In vitro metilazione Assay per studiare proteine Arginina Metilazione
Summary
Proteine arginina metilazione, catalizzata da una classe di enzimi viz., Proteina arginina metil transferasi (PRMTs), è il processo di aggiunta enzimatica di gruppi metile (s) per arginines all'interno di proteine. Il test in vitro metilazione è lo strumento più affidabile per valutare lo stato di metilazione di substrati PRMT noti o nuovi.
Abstract
Proteina arginina metilazione è una delle più abbondanti modificazioni post-traduzionali nel nucleo. Proteine arginina metilazione può essere identificato e / o determinato mediante approcci di proteomica, e / o immunoblotting con anticorpi specifici metil-arginina. Tuttavia, queste tecniche a volte possono essere fuorvianti e spesso fornire risultati falsi positivi. Soprattutto, queste tecniche non possono fornire prove dirette a sostegno della specificità di substrato PRMT. In vitro test di metilazione, d'altra parte, sono saggi biochimici utili, che sono sensibili, e costantemente rivelano se le proteine identificate sono davvero substrati PRMT. Un tipico test di metilazione in vitro comprende purificati, PRMTs attivi, substrato purificato e un radioisotopo marcato donatore di metile (S-adenosil-L-[metil-3 H] metionina). Qui si descrive un protocollo step-by-step per isolare PRMT1 cataliticamente attivo, un membro della famiglia PRMT ubiquitariamente espresso. Il meThyl attività transferasi del PRMT1 purificato sono stati successivamente testati su Ras-GTPasi attivando binding protein 1 (G3BP1) proteina, un substrato PRMT noto, in presenza di S-adenosil-L-[metil-3H] metionina come donatore di metile. Questo protocollo può essere impiegato non solo per stabilire lo stato di metilazione di nuovi substrati PRMT1 fisiologici, ma anche per comprendere il meccanismo di base della proteina arginina metilazione.
Introduction
Proteine metilazione è stata descritta per la prima nel 1968 1. Fu solo la prima clonazione di PRMT1 nel 1996, che i ricercatori hanno cominciato ad apprezzare l'importanza di questa modificazione post-traslazionale 2. È interessante notare che circa il 2% dei residui di arginina nelle proteine di estratti nucleari sono metilato 3, che indica l'abbondanza di questa modifica. L'arginina è un aminoacido carico positivamente con una catena laterale di base ei azoto / s all'interno delle catene laterali di arginina può essere post-traduzionali modificato mediante l'aggiunta di un gruppo metile, un processo noto come arginina metilazione 4-6. Metilazione Arginina è catalizzata da una classe di enzimi viz., Transferasi proteine metile arginina (PRMTs). Arginine possono sia essere monometilato o dimethylated la quale può essere sia simmetrica o asimmetrica a seconda del tipo di PRMTs catalizzano il processo 4-6.
Le proteine che visualizzano argininaricchi di motivi e-glicina sono potenziali bersagli per la catalisi PRMT-mediata. PRMT mediata da metilazione dei substrati è stato dimostrato di modulare l'interazione proteina-proteina, l'interazione proteina-acido nucleico, la funzione della proteina, l'espressione genica, e / o di segnalazione cellulare, che sono tutti critici per la normale omeostasi cellulare 7-9. Al fine di comprendere il ruolo biologico delle proteine arginina metilazione, precisi, efficienti e riproducibili test sono necessari per stabilire lo stato di metilazione dei substrati PRMT identificati.
In vitro la metilazione, che valuta le capacità di PRMTs purificati per catalizzare metilazione dei loro substrati, è un saggio ben accettato per lo studio metilazione arginina 10-12. Il successo complessivo di questo test dipende in gran parte l'attività dei PRMTs purificati. PRMTs possono essere espressi e purificati da batteri o cellule di mammifero 10,11. Questa metilazione test in vitro, come dNell'odontoiatria nella sezione del protocollo, si basa su un metodo originariamente descritto da Tini e colleghi 10. In questo protocollo, vi mostriamo nel dettaglio i passaggi necessari per l'espressione e la purificazione di PRMT1 in cellule di mammifero. La capacità del PRMT1 purificato per catalizzare metilazione su Ras-GTPasi attivando la proteina binding protein 1 (G3BP1), un noto substrato PRMT 8, è stato poi valutato in presenza di S-adenosil-L-[metil-3 H] metionina come donatore di metile. Usando questo test, possiamo definire in modo affidabile le capacità dei PRMTs di romanzo metilato o substrati noti, che è un passo fondamentale nello studio della proteina arginina metilazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descritto è abitualmente utilizzato per stabilire lo stato di metilazione dei substrati PRMT identificati. Questo test robusto e coerente fornirà anche prove definitive sulla specificità del PRMTs per i loro substrati. I componenti chiave per il successo di questo test sono: 1 Espressione di PRMTs in cellule di mammifero, 2 attività di PRMTs purificati, 3 Espressione e purificazione di substrato, e 4 completo trasferimento occidentale delle proteine alla membrana di nitrocellulosa.
<p cla…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto da un Merit Award dalla US Department of Veterans Affairs, e un NIH concedere R01CA138528 a RW.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine | Perkin Elmer | ||
| Ecoscint ultra | National Diagnostics | LS-270 | |
| Bottle top dispenser | National Diagnostics | LS-900 | |
| AutoFluor | National Diagnostics | LS-315 | |
| 6 ml Scintillation Vials | National Diagnostics | SKU:SVC-06 | |
| GST-sepharose | GE Life Sciences | ||
| L-Glutathione Reduced | Sigma | G4251 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | Transfection reagent | |
| Beas2B | ATCC | ||
| Optimem | Invitrogen | ||
| NP-40 | US-Biologicals | ||
| SDS | Sigma | ||
| Sodium deoxycholate | Sigma | ||
| PMSF | Sigma | ||
| anti-HA affinity matrix | Roche | ||
| Tris | Sigma | ||
| Nacl | Sigma | ||
| Bio-rad gel doc | Bio Rad | ||
| anti-HA antibody | roche | ||
| Ponseau S | Fisher Scientific |
References
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