Protein arginin metylering, katalysert av en klasse av enzymer viz. Protein arginin metyl transferaser (PRMTs), prosessen for enzymatisk tilsetning av metyl-gruppen (e) til arginines innenfor proteiner. Den in vitro-metylering analysen er den mest pålitelige verktøy for å bedømme status for metylering kjente eller nye PRMT substrater.
Protein arginin metylering er en av de mest tallrike posttranslasjonelle modifikasjoner i kjernen. Protein arginin metylering kan identifiseres og / eller bestemmes via proteomic nærmer seg, og / eller immunoblotting med metyl-arginin-spesifikke antistoffer. Imidlertid er disse teknikker kan noen ganger være misvisende og gir ofte falske positive resultater. Viktigst, kan disse teknikkene ikke gir direkte bevis til støtte for PRMT substratspesifisitet. In vitro assays metylering, på den annen side, er nyttige biokjemiske analyser, som er følsom, og konsekvent avdekke om de identifiserte proteiner er faktisk PRMT substrater. Et typisk in vitro-analysen omfatter metylering rensede, aktive PRMTs, renset substrat og en radioisotop-merket metyl donor (S-adenosyl-L-[metyl-3H] metionin). Her beskriver vi en steg-for-steg-protokollen for å isolere katalytisk aktivt PRMT1, en ubiquitously uttrykt PRMT familiemedlem. Den megmetyl- transferase aktivitet av det rensede PRMT1 ble senere testet på Ras-GTPase aktiverende protein-bindende protein 1 (G3BP1), en kjent PRMT substrat, i nærvær av S-adenosyl-L-[metyl-3H] metionin som metyl donor. Denne protokollen kan bli benyttet ikke bare for å etablere en status metylering av nye fysiologiske PRMT1 substrater, men også for å forstå den grunnleggende mekanisme for protein arginin metylering.
Protein metylering ble først beskrevet i 1968. 1. Det var ikke før den første kloning av PRMT1 i 1996, at forskere begynte å forstå viktigheten av denne post-translasjonell modifikasjon to. Interessant nok er omtrent 2% av arginin rester i proteiner av nukleære ekstrakter metylert 3, som indikerer at overflod av denne modifikasjon. Arginin er en positivt ladet aminosyre med en sidekjede, og grunnleggende nitrogen / s i løpet av sidekjedene av arginin kan være post-translasjonelt modifisert gjennom tilsetning av en metylgruppe, en prosess kjent som arginin metylering 4-6. Arginin metylering er katalysert av en klasse av enzymer viz. Protein, arginin metyl-transferaser (PRMTs). Arginines kan enten monomethylated eller dimethylated og sistnevnte kan være enten symmetrisk eller asymmetrisk alt etter den type PRMTs katalyserende prosess 4-6.
Proteiner som viser Arginine-glysin rike motiver er potensielle mål for PRMT-mediert katalyse. PRMT-mediert metylering av substrater er vist å modulere protein-protein interaksjon, protein-nukleinsyre interaksjon, proteinfunksjon, genekspresjon og / eller cellulær signalisering, som alle er kritisk for normal cellulær homeostase 7-9. For å forstå den biologiske rolle av protein arginin metylering, er nøyaktig, effektiv og reproduserbar analyser som kreves for å etablere den metylering status for de identifiserte PRMT substrater.
In vitro-assay metylering, som evaluerer evnene rensede PRMTs å katalysere metylering av deres substrater, er en godt akseptert test for å studere arginin metylering 10-12. Den generelle suksess for denne analysen avhenger i stor grad aktiviteten av de rensede PRMTs. PRMTs kan bli uttrykt og renset fra bakterier, pattedyrceller eller 10,11. Denne in vitro-assay metylering, som detailed i protokollen delen, er basert på en metode som opprinnelig ble beskrevet av Tini og kolleger 10. I denne protokollen, viser vi i detalj trinnene involvert i uttrykket og rensing av PRMT1 i pattedyrceller. Evnen til rensede PRMT1 å katalysere metylering på Ras-GTPase aktiverende protein-bindende protein 1 (G3BP1), en kjent PRMT substrat 8, ble senere undersøkt i nærvær av S-adenosyl-L-[metyl-3H] metionin som den metyl donor. Ved hjelp av dette assay, kan vi definere pålitelig evnene til PRMTs til metylat nye eller kjente substrater, som er et primært trinn i studiet av protein arginin metylering.
Den protokoll som er beskrevet her brukes rutinemessig for å etablere den metylering status for de identifiserte PRMT substrater. Denne robuste, og konsekvent analysen vil også gi definitive bevis på det spesielle ved PRMTs for sine underlag. De viktigste komponenter for suksess for denne analysen er: 1. Ekspresjon av PRMTs i pattedyrceller, 2. Aktivitet av rensede PRMTs, 3. Ekspresjon og rensing av substrat, og 4. Fullstendig western overføring av proteinene til nitrocellulose-membran.
…
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av en Merit Award fra US Department of Veterans Affairs, og en NIH gi R01CA138528 til RW.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine | Perkin Elmer | ||
Ecoscint ultra | National Diagnostics | LS-270 | |
Bottle top dispenser | National Diagnostics | LS-900 | |
AutoFluor | National Diagnostics | LS-315 | |
6 ml Scintillation Vials | National Diagnostics | SKU:SVC-06 | |
GST-sepharose | GE Life Sciences | ||
L-Glutathione Reduced | Sigma | G4251 | |
Lipofectamine | Invitrogen | Transfection reagent | |
Beas2B | ATCC | ||
Optimem | Invitrogen | ||
NP-40 | US-Biologicals | ||
SDS | Sigma | ||
Sodium deoxycholate | Sigma | ||
PMSF | Sigma | ||
anti-HA affinity matrix | Roche | ||
Tris | Sigma | ||
Nacl | Sigma | ||
Bio-rad gel doc | Bio Rad | ||
anti-HA antibody | roche | ||
Ponseau S | Fisher Scientific |