Tek kullanımlık Pnömatik Biyoreaktör Sistemi kullanılarak memeli hücrelerinde yetiştirme
Summary
Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.
Abstract
Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor’s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.
Introduction
Süspansiyon içinde büyümeye hücreleri, agregat Çoğalan hücreler, ve hücreler, bir alt-tabakaya sabitlenmiş yükselmektedir memeli hücre soyları büyüme özelliklerine göre üç kategoriye ayrılabilir. Bu video gösterilen hava tekerlekli biyoreaktör hücrelerin her üç tip büyümeye mümkün olsa da, bu video mikro-taşıyıcılar üzerinde ankoraj-bağımlı hücreleri büyütmek için bioreaktörün kullanımını gösterecektir. , Hücreler ürünü – ankoraj-bağımlı hücreleri daha memeli hücreleri üretmek amacıyla yetiştirilebilir. Örneğin, insan kemik iliği kökenli mezenkimal kök ile henüz hücrelerin hasat edilmesi ve hastalıklı doku içine enjekte edilmesi ile yetiştirilmektedir. Bu video gösterilen pnömatik biyoreaktör bu uygulama için bu tür mezenkimal kök hücrelerin üretilmesi için uygun olduğu kanıtlanmıştır (Serra et al., Kişisel iletişim, 2013).
Anchorage dependent memeli hücreleri, tipik olarak, özel bir muamele edilmiş büyüme yüzeyi 1 'e uygun hücre kültür plakaları, hücre kültürü şişeleri veya silindir şişelerde, 2B kültür kabına küçük çaplı büyütülür. Daha fazla hücre arzu edildiği zaman, ya da plakalar, şişeler daha fazla ya da daha büyük damarların kullanılarak genişletilebilir. Bununla birlikte, daha düşük maliyetli bir ankoraj-bağımlı hücrelerin büyük miktarlarda kültivasyonu, hücre bağlanması için yüzey alanını artırmak için gerekli mikro-taşıyıcılar olarak adlandırılan küçük bir katı boncuklar kullanılarak gerçekleştirilebilir. Hücrenin bağlanma özelliklerine bağlı olarak, mikro-taşıyıcılar birden fazla değişik tipte örneğin kaplanmış dekstran, peptid, ya da kolajen gibi, ticari olarak temin edilebilir. Mikro taşıyıcılar, hücre büyümesi için daha geniş bir yüzey alanı hacim oranı sağlamak için geniş bir yüzey alanına sahiptir; ve mikro taşıyıcılar, hücreler biyoreaktör de 2 yüksek yoğunluklarda kültive edilmesini sağlar çalkalama ile süspansiyon içinde muhafaza edilebilir. Biorea Şu anda, türleriyapışık hücreler mikro-taşıyıcılar üzerinde yetiştirilen ctors hücre kaplı mikro-taşıyıcı süspansiyonu sağlamak için eksenel pervaneler kullanır döndürme şişeleri ve karıştırılmıştır tankı sistemleri içerir.
Çeşitli faktörler, oksijen gerilimi, kesme stresi, yüzey matris ve bir gıda maddesi ve metabolit konsantrasyonları dahil olmak üzere, hücrelerin başarılı bir şekilde ekimi için önemlidir. Biyoreaktörler kullanılması, gerçek zamanlı büyüme koşullarının izlenmesi ve önemli ölçüde daha düşük üretim maliyetleri 1'e potansiyeli sağlar. Dahil olmak üzere, in vitro hücre ekimi, karıştırılmış bir süspansiyona, dönen duvar kap, içi boş elyaf, bir rocker platformunda torba biyoreaktör ve akışkan yataklı sistemler 3 birçok ortak biyo-reaktör tasarımları vardır. Bu sistemlerin birçoğu gibi yüksek maliyet besin konsantrasyonu geçişlerini, hidrodinamik kesme, hücre toplama ve zorluk örnekleme, izleme ve kontrol cel gibi, hücre ekimi için benzersiz sorunları sunmak ve -up ölçekl ölçek-up.
Çeşitli yapışık hücre çizgileri, viral aşıların üretimi veya gen terapi uygulamaları için viral vektörlerin üretimi için ya da, virüs üretiminde kullanılmaktadır. Bu video, tek kullanımlık hava basınçlı (Hava Tekerlek) biyoreaktör sistemi kullanılarak, insan akciğer kanser hücreleri (A549) bir onkolitik adenovirüsün üretimi için mikro-taşıyıcılar üzerinde hücre kültürünü göstermektedir. Pnömatik biyoreaktör tasarımı bioreaktörün dibine serpilmiştir gaz kaldırma kuvveti tarafından desteklenmektedir dikey bir çalkalama tekerlek kullanır. Bu nazik Karıştırma yöntemi hidrodinamik kesme kuvvetleri sınırlar, ama yine de iyi, orta ve hücre 4 karıştırma sağlar. Karıştırılmakta olan tank reaktörden ile karşılaştırıldığında, pnömatik reaktör daha yüksek hacimli hava Teker biyoreaktör sistemleri (Şekil 1) olarak düşük duvar kesme stresine sahip bulunmaktadır. Karıştıran tank biçimindeki bioreaktörlerde aksine, bu tek kullanımlık reaktörün dikey itici gaz kabarcıklarının akışı içinde tarafından açıldığındaYumuşak ve düzgün karıştırma ortamı (Şekil 2) sağlayan kabından oluşur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu tek kullanımlık biyoreaktör sisteminin kullanımı nispeten basittir ve reaktör izleme ve analiz için gerçek zamanlı bir analiz içerir. Bu, son derece iyi 30000000 fazla hücre / ml hücre yoğunluğu ile ulaşan memeli ve böcek hücre kültürü için uygundur. A549 hücreleri, bu raporda 11'de tarif yanı sıra, hem de biyoreaktör SF-9 böcek hücreleri büyüdü. Pnömatik hava tekerleği tarafından sağlanan nazik karıştırma hücre hasarı azaltır. Bu reaktör kurarken birkaç adım önemlidir. İlk olarak, uygun bir pH kalibrasyonu ve sensörler kültür uygun izlenmesi için ve pH-değerini ya da sistemde oksijen ayarlamak için reaktifler ilave önemlidir DO. İkinci olarak, reaktif ve tohum şişe doldurulmuş ve diş ek bir BSC gibi, steril bir ortamda yapılmalıdır. Reaktif şişeleri steril ortamda dışına taşındı sonra, biyoreaktör besleme hatlarına bağlantıları mikrobik kontaminasyonu önlemek için dikkatle yapılmalıdır.
<pclass = "jove_content"> Bu biyoreaktör sistemi bakteri kültürleri için tasarlanmış değildir memeli ve böcek hücre hatları için iyi çalışıyor. Sistem, bakteri hücreleri için gerekli olan, hızlı karıştırma ve oksijen sağlayamaz. Bakteriyel çoğalma iyi bir karıştıran bioreaktör içinde gerçekleştirilir. Memeli ya da böcek hücre kültürü için diğer tek kullanımlık biyoreaktörlerde karşılaştırıldığında, bu sistem, kullanımı kolay çalışır analiz için yeterli veri sağlar ve biz değerlendirdik diğer tek kullanımlık sisteminden daha benzer veya daha iyi hücre büyümesini vardır.Tek kullanım için pnömatik biyoreaktör sistemi hücreleri, araştırma ve Biotherapeutics, aşıların alanda klinik uygulamaların bir çoğu yerine kök potansiyel ve kişiselleştirilmiş ilaç 4 sahiptir. Buna ek olarak, bu sistemin esnekliği Batch, ilaveli-fasılalı, serpme, ve transfeksiyonu göre biyoreaktör uygulamalar 5 sağlar. Son olarak, tek kullanımlık biyoreaktör sistemi potansiyeli taşıdığıbüyük ölçekli sanayi üretim ihtiyaçlarını karşılamak için kurallar ve ulusal ve uluslararası düzenleyici kurumlar 6-10 tavsiyelerine uymak için TIAL.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was support in part by Johns Hopkins University, Office of the Provost through the Gateway Science Initiative.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| PBS 3 | PBS | n/a | |
| Single Use Assembly | PBS | n/a | |
| Human Lung Carcinoma Cells (A549) | ATCC | CCL-185 | |
| DMEM High Glucose Medium | |||
| Fetal Bovine Serum | |||
| Trypsin EDTA, 0.25% | |||
| Cytodex 1 Microcarriers | GE | 3781 | |
| Antifoam C | Sigma | A8011 |
References
- Freshney, R. I. . Culture of Animal Cells A Manual of Basic Techniques and Specialized Applications. , (2010).
- Healthcare, G. E. Microcarrier Cell Culture Principles and Methods. GE Healthcare Data File 18-1140-62. , (2005).
- Simaria, A. S., et al. Allogeneic cell therapy bioprocess economics and optimization Single-Use cell expansion Technologies. Biotechnol and Bioeng. 111 (1), 69-83 (2014).
- Lee, B., Fang, D., Croughan, M., Carrondo, M., Paik, S. -. H. Characterization of novel pneumatic mixing for single-use bioreactor application. BMC Proc. 5 (S8), O12 (2011).
- Eibl, R., Eibl, D. Disposable bioreactors in cell culture-based upstream processing. BioProcess Int. 7 (S1), 18-23 (2009).
- Chaubard, J. F., et al. Disposable bioreactors for viral vaccine production challenges and opportunities. Biopharm Int Supp. , (2010).
- Croughan, M. S., Hamel, J. F., Wang, D. I. C. Hydrodynamic Effects on Animal Cells Grown in Microcarrier Cultures. Biotechnol and Bioeng. 95 (2), 295-305 (2006).
- DePalma, A. Single-use Equipment on Cusp of Industrialization. Genet Eng Biotechnol News. 32 (1), (2012).
- Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. . Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. , (2010).
- Sousa, M. F., Giroux, D., Clemente, J., Lee, B., Carrondo, M. J., Alves, P. M. . Impact of Bioreactor Design on the Performance of Microcarrier Cultures. , (2012).
