השרשה של הפיברין ג'ל על עכבר ריאות לחקר אנגיוגנזה ריאות ספציפית
Summary
Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.
Abstract
התקדמות משמעותית האחרונה בטכניקות מחקר בתאי גזע וביו-הנדסה עשו התקדמות גדולה בניצול ביו-חומרים להתחדש ולתקן את הנזק ברקמות פשוטות בתחומי האורתופדים וחניכיים. עם זאת, הניסיונות לחדש את המבנה ותפקוד של איברים מורכבים יותר תלת ממדי (3D) כגון ריאות לא היה מוצלח מאוד בגלל התהליכים הביולוגיים של התחדשות איבר לא נחקרו היטב. זה הופך להיות ברור שאנגיוגנזה, היווצרותם של כלי דם חדשים, ממלאת תפקידי מפתח בהתחדשות איבר. שהוקם זה עתה vasculatures לספק לא רק חמצן, חומרי מזון ומרכיבי תא שונים הנדרשים להתחדשות איבר אלא גם לספק אותות מאלפות לרקמות המקומיות ההתחדשות. לכן, כדי להתחדש בהצלחה ריאות במבוגרים, יש צורך לשחזר את microenvironments הריאות ספציפיות שבי אנגיוגנזה התחדשות של רקמות ריאה כוננים מקומיות. למרות שיתוףnventional in vivo מבחני אנגיוגנזה, כגון השתלה תת-עורית של מטריצה תאית (ECM) -rich הידרוג (למשל, ג'לים הפיברין או קולגן או Matrigel – תערובת חלבוני ECM מופרש על ידי תאי סרקומה עכבר Engelbreth-הולם-נחיל), באופן נרחב מנוצל כדי לחקור את מנגנונים כלליים של אנגיוגנזה, אנגיוגנזה ריאות ספציפיות לא מאופיין היטב כי שיטות להשתלת orthotopic של ביו-חומרים בריאות לא היו מבוססות היטב. המטרה של פרוטוקול זה היא להציג את שיטה ייחודית להשתלת ג'ל הפיברין על פני השטח הריאות של עכבר בוגר חיים, המאפשרת לסיכום המוצלח של אנגיוגנזה-נגזר ריאות המארח בתוך הג'ל. גישה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את המנגנונים שבאמצעותם מייקרו-סביבת הריאות ספציפיות שולט אנגיוגנזה והתחדשות alveolar בשני תנאים נורמלים ופתולוגיים. מאז שחרור ביו-חומרים מושתלים ולספק אותות פיסיקליים וכימיים לl הסמוךרקמות ung, השתלה של ביו-חומרים אלה על ריאות חולות עלולה לנרמל את הרקמות חולות הסמוכות, המאפשרות לחוקרים לפתח גישות טיפוליות חדשות לסוגים שונים של מחלות ריאה.
Introduction
המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להציג את השיטה להשתיל ג'ל הפיברין על פני השטח הריאות של עכבר בוגר, המאפשר לחוקרים לאפיין את המנגנונים המולקולריים של כלי דם ריאה ופיתוח alveolar, ולמנף את הידע הזה כדי לפתח חומרי biomimetic מסוגל של כלי דם ריאה משחזר פיסיולוגיים והיווצרות מכתשי לטיפול במחלות ריאה שונות.
יותר מ -35 מיליון אמריקאים סובלים ממחלות ריאה כרוניות, כוללים מחלת ריאות חסימתית כרונית ופיברוזיס ריאתי. חולים אלה סימפטומים לטווח ארוך כרוניים בדרכי הנשימה כגון קוצר נשימה, לחץ בחזה, שיעול טורדני, ועייפות, שפוגעים בחיי היום היום שלהם 1-3 באופן משמעותי. למרות כמות גדולה של מאמץ לפתח טיפולים יעילים למחלות ריאה אלה, כיום אין תרופה; לכן, איכות חיים של חולים אלה היא עניה וכלכלי ועלויות אנושיות הייGH 4-7. נכון לעכשיו, השתלת ריאות היא הדרך היחידה להציל את החולים עם מחלות ריאה כרונית סופנית. עם זאת, בגלל המחסור בתורמים להשתלה, עלות גבוהה, סיבוכים חמורים, ושיעור הישרדות נמוך 8-11, השתלה היא לא גישה אופטימלית. התקדמות מהירה בטכניקות האחרונות הנדסת רקמות אפשרה לחוקרים bioengineer ריאות מושתלים על ידי אכלוס מחדש כל ריאות decellularized עם סוגים שונים של תאים או תאי גזע pluripotent מושרה (iPS) 12,13. עם זאת, ריאות bioengineered אלה הן פונקציונליות בבעלי החיים מארח רק לכמה שעות לאחר 12,14,15 השתלה. גם ניצול ביו-חומרים להתחדש מבנים ופונקציות המורכבים של ריאות היה די מוצלח. זה יכול להיות בגלל תהליכים ביולוגיים מרכזיים ששולטים בהתחדשות ריאות מבוגרים לא נחקרו היטב. בריאות, היווצרות של מערכת כלי הדם היא אחד מהאירועים המוקדמים והחשובים ביותר duriפיתוח ng והתחדשות 16-21. שהוקם זה עתה בvasculatures הריאות לא גם לספק רק חמצן, חומרי מזון ומרכיבי תא שונים הנדרשים להיווצרות איברים, אלא לספק אותות רגולציה מאלפות לתאים המקיפים 22-25. לפיכך, אנגיוגנזה משחקת תפקידי מפתח בalveolarization משובי בריאות מבוגרים 24,26,27. בנוסף, אנגיוגנזה deregulated תורמת למחלות ריאה כרוניות כגון מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) 28, דיספלזיה bronchopulmonary (BPD) 21-23, ופיברוזיס ריאתי 29. לכן, כדי לפתח אסטרטגיות יעילים יותר להנדסת ריאות או טיפול במחלות ריאה כרוניות, יש צורך להבין את המנגנונים הבסיסיים של אנגיוגנזה ריאות ספציפיות.
כל איבר מציג תכונות מכאניות וכימיות ייחודיות, אשר עשוי להיות שונה בין תנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים 30-33. microenviron איבר ספציפי אלהמפעלים לווסת התנהגויות תא האנדותל ולתזמר יצירת רשת כלי דם באופן ספציפי לאיבר 24,34-36. לכן, כדי לפתח אסטרטגיות יעילים יותר להתחדשות ריאות, המנגנון שבבסיס אנגיוגנזה ריאות ספציפיות צריך להיות מובן. בעוד מבחני אנגיוגנזה קונבנציונליים in vivo כגון השתלה תת עורית הידרוג'ל נעשו שימוש נרחב למחקר אנגיוגנזה 37-39, שיטות אלה לא לשחזר אנגיוגנזה איבר ספציפי. לאחרונה, שיטה חדשנית להשתלת Matrigel בעובש אלסטי על ריאות העכבר פותחה והוצגה בהצלחה לגייס כלי דם ותאי האפיתל ריאות לג'לים 22. גישה ייחודית זו תאפשר לחוקרים לחקור את המנגנון של אנגיוגנזה ריאות ספציפיות, כמו גם יחסי גומלין בין כלי דם ותאי ריאה שאינם כלי דם בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. מאז 1) Matrigel אינו מתאים ליישום קליני; 2) הדוארעובש lastic משמש כדי להפיל את ג'ל עשוי להשפיע על יחסי גומלין בין הידרוג ורקמת ריאה מארח ו -3) עובש אלסטי על הריאות שעלול להיות גורם פגיעה בתפקוד ריאות וכאב בזמן הנשימה, כגישה רלוונטית יותר מבחינה קלינית, מטריצת הפיברין 3D המכיל גורמי angiogenic (פקטור גדילה של אנדותל כלי דם (VEGF) / גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF)) כבר מושתל על ריאות העכבר ללא יציקה בתבנית הגמישה, וסכם אנגיוגנזה המופקת ריאות מארח בהצלחה. ג'ל ליפין, סיבי פולימר שנוצרו מפיברינוגן-ביקע תרומבין, ידוע למלכודת מגוון גורמי angiogenic כגון bFGF וVEGF להאיץ אנגיוגנזה in vivo 40,41. בשל יכולת ההתחדשות שלו והטבע מתכלה 42, ג'ל הפיברין נעשה שימוש נרחב בתחום הנדסת רקמות.
מאמר זה מציג רומן וגישה ייחודית להשתלת ג'ל הפיברין על פני השטח הריאות של adul חייםעכבר ולא מוכיח כי אנגיוגנזה המופקת ריאות המארח סכמה בתוך ג'לי in vivo. שיטה זו, המאפשרת לחוקרים ללמוד אנגיוגנזה ריאות ספציפיות, צפויה להוביל לפיתוח גישות טיפוליות חדשות לסוגים שונים של מחלות ריאה ולקדם באופן משמעותי את המאמצים לחדש ריאות מבוגרים בהצלחה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מציג שיטה חדשה להשתלה בביו-חומרים על פני השטח הריאות של חיים עכבר בוגר. עם מערכת זו, אנגיוגנזה נגזרת-ריאה המארח סכמה בהצלחה בתוך החומר. מערכת זו מאפשרת לחוקרים לחקור crosstalk בין תאי אנדותל, תאים אחרים (לדוגמא, תאי אפיתל, תאי mesenchymal, תאי מערכת חיסון) ורכיבי ECM שו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מאיגוד לב אמריקאי (בבוקר), משרד הגנה האמריקאי (BC074986), ובית החולים הפקולטה פיתוח הקריירה המלגה לילדים בבוסטון (TM, בבוקר). המחברים מודים אמנדה ג'יאנג ואליזבת ג'יאנג לקבלת סיוע טכני.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Fibrinogen from human placenta | Sigma | F4883 | For fabrication of fibrin gel |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma | T9549 | For fabrication of fibrin gel |
| Recombinant mouse VEGF 164 | R&D | 493-MV | For supplementation to fibrin gel |
| Recombinant mouse bFGF | R&D | 3139-FB | For supplementation to fibrin gel |
| Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific INC | RIS 100 | For intubation |
| Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12-565-35 | For intubation |
| 20G Elastic catheter | B.Braun | 4251652-02 | For intubation |
| MiniVent Ventilator | Harvard Apparatus | CGS-8009 | For ventilation |
| Stemi DV4 Steromicroscope | Fisher Scientific | 12-070-515 | For surgey |
| Absobable suture | Ethicon | PDP304 | Surgical suture |
| Antibody against CD31 | BD Biosciences | 553370 | Immunohistochemistry |
| Antibody against AQP5 | Abcam | AB78486 | Immunohistochemistry |
| Antibody against SP-B | Millipore | AB40876 | Immunohistochemistry |
References
- Donaldson, G. C., Seemungal, T. A., Bhowmik, A., Wedzicha, J. A. Relationship between exacerbation frequency and lung function decline in chronic obstructive pulmonary disease. Thorax. 57, 847-852 (2002).
- Lopez-Campos, J. L., Calero, C., Quintana-Gallego, E. Symptom variability in COPD: a narrative review. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 8, 231-238 (2013).
- Ley, B., Collard, H. R., King, T. E. Clinical course and prediction of survival in idiopathic pulmonary fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 183, 431-440 (2011).
- Ferrer, M., et al. Chronic obstructive pulmonary disease stage and health-related quality of life. The Quality of Life of Chronic Obstructive Pulmonary Disease Study Group. Ann Intern Med. 127, 1072-1079 (1997).
- Reardon, J. Z., Lareau, S. C., ZuWallack, R. Functional status and quality of life in chronic obstructive pulmonary disease. Am J Med. 119, 32-37 (2006).
- De Vries, J., Kessels, B. L., Drent, M. Quality of life of idiopathic pulmonary fibrosis patients. Eur Respir J. 17, 954-961 (2001).
- Sullivan, S. D., Ramsey, S. D., Lee, T. A. The economic burden of COPD. Chest. 117, 5S-9S (2000).
- Orens, J. B., Garrity, E. R. General overview of lung transplantation and review of organ allocation. Proc Am Thorac Soc. 6, 13-19 (2009).
- Benden, C. Specific aspects of children and adolescents undergoing lung transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 17, 509-514 (2012).
- Lyu, D. M., Zamora, M. R. Medical complications of lung transplantation. Proc Am Thorac Soc. 6, 101-107 (2009).
- Trulock, E. P., et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: twenty-fourth official adult lung and heart-lung transplantation report-2007. J Heart Lung Transplant. 26, 782-795 (2007).
- Weiss, D. J. Current status of stem cells and regenerative medicine in lung biology and diseases. Stem Cells. 32, 16-25 (2013).
- Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J Clin Invest. 123, 4950-4962 (2013).
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat Med. 16, 927-933 (2010).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
- Tuyl, M., et al. Angiogenic factors stimulate tubular branching morphogenesis of sonic hedgehog-deficient lungs. Dev Biol. 303, 514-526 (2007).
- Galambos, C., deMello, D. E. Molecular mechanisms of pulmonary vascular development. Pediatr Dev Pathol. 10, 1-17 (2007).
- McGrath-Morrow, S. A., et al. Vascular endothelial growth factor receptor 2 blockade disrupts postnatal lung development. Am J Respir Cell Mol Biol. 32, 420-427 (2005).
- White, A. C., Lavine, K. J., Ornitz, D. M. FGF9 and SHH regulate mesenchymal Vegfa expression and development of the pulmonary capillary network. Development. 134, 3743-3752 (2007).
- Zhao, L., Wang, K., Ferrara, N., Vu, T. H. Vascular endothelial growth factor co-ordinates proper development of lung epithelium and vasculature. Mech Dev. 122, 877-886 (2005).
- Stenmark, K. R., Abman, S. H. Lung vascular development: implications for the pathogenesis of bronchopulmonary dysplasia. Annu Rev Physiol. 67, 623-661 (2005).
- Mammoto, T., et al. LRP5 Regulates Development of Lung Microvessels and Alveoli through the Angiopoietin-Tie2 Pathway. . PLoS ONE. 7, e41596 (2012).
- Mammoto, T., Jiang, E., Jiang, A., Mammoto, A. ECM structure and tissue stiffness control postnatal lung development through the LRP5-Tie2 signaling system. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49, 1009-1018 (2013).
- Ding, B. S., et al. Endothelial-derived angiocrine signals induce and sustain regenerative lung alveolarization. Cell. 147, 539-553 (2011).
- Crivellato, E. The role of angiogenic growth factors in organogenesis. Int J Dev Biol. 55, 365-375 (2011).
- Sakurai, M. K., et al. Vascular endothelial growth factor accelerates compensatory lung growth after unilateral pneumonectomy. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 292, 742-747 (2007).
- Panigrahy, D., et al. Epoxyeicosanoids promote organ and tissue regeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 13528-13533 (2013).
- Voelkel, N. F., Douglas, I. S., Nicolls, M. Angiogenesis in chronic lung disease. Chest. 131, 874-879 (2007).
- Hanumegowda, C., Farkas, L., Kolb, M. Angiogenesis in pulmonary fibrosis: too much or not enough. Chest. 142, 200-207 (2012).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Mammoto, A., Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanosensitive mechanisms in transcriptional regulation. J Cell Sci. 125, 3061-3073 (2012).
- Westermann, D., et al. Role of left ventricular stiffness in heart failure with normal ejection fraction. Circulation. 117, 2051-2060 (2008).
- Merchante, N., et al. Liver stiffness predicts clinical outcome in human immunodeficiency virus/hepatitis C virus-coinfected patients with compensated liver cirrhosis. Hepatology. 56, 228-238 (2012).
- Ding, B. S., et al. Inductive angiocrine signals from sinusoidal endothelium are required for liver regeneration. Nature. 468, 310-315 (2010).
- Fidler, I. J. Angiogenic heterogeneity: regulation of neoplastic angiogenesis by the organ microenvironment. J Natl Cancer Inst. 93, 1040-1041 (2001).
- Folkman, J. How is blood vessel growth regulated in normal and neoplastic tissue? G.H.A. Clowes memorial Award lecture. Cancer Res. 46, 467-473 (1986).
- Mammoto, A., et al. A mechanosensitive transcriptional mechanism that controls angiogenesis. Nature. 457, 1103-1108 (2009).
- Malinda, K. M. In vivo matrigel migration and angiogenesis assay. Methods Mol Biol. 467, 287-294 (2009).
- Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10, 588-612 (2006).
- Mammoto, T., Jiang, A., Jiang, E., Mammoto, A. Platelet rich plasma extract promotes angiogenesis through the angiopoietin1-Tie2 pathway. Microvasc Res. 89, 15-24 (2013).
- Mosesson, M. W. Fibrinogen and fibrin structure and functions. J Thromb Haemost. 3, 1894-1904 (2005).
- Bensaid, W., et al. A biodegradable fibrin scaffold for mesenchymal stem cell transplantation. Biomaterials. 24, 2497-2502 (2003).
- Teichert-Kuliszewska, K., et al. Biological action of angiopoietin-2 in a fibrin matrix model of angiogenesis is associated with activation of Tie2. Cardiovasc Res. 49, 659-670 (2001).
- Lafleur, M. A., Handsley, M. M., Knauper, V., Murphy, G., Edwards, D. R. Endothelial tubulogenesis within fibrin gels specifically requires the activity of membrane-type-matrix metalloproteinases (MT-MMPs). J Cell Sci. 115, 3427-3438 (2002).
- Collen, A., et al. Aberrant fibrin formation and cross-linking of fibrinogen Nieuwegein, a variant with a shortened Aalpha-chain, alters endothelial capillary tube formation. Blood. 97, 973-980 (2001).
- Mammoto, T., et al. Mechanochemical Control of Mesenchymal Condensation and Embryonic Tooth Organ Formation. Dev Cell. 21, 758-769 (2011).
- Murphy, K. C., Leach, J. K. A reproducible, high throughput method for fabricating fibrin gels. BMC Res Notes. 5, 423 (2012).
- Matar, A. F., Hill, J. G., Duncan, W., Orfanakis, N., Law, I. Use of biological glue to control pulmonary air leaks. Thorax. 45, 670-674 (1990).
- Thetter, O. Fibrin adhesive and its application in thoracic surgery. Thorac Cardiovasc Surg. 29, 290-292 (1981).
- Rahbarghazi, R., et al. Juxtacrine and paracrine interactions of rat marrow-derived mesenchymal stem cells, muscle-derived satellite cells, and neonatal cardiomyocytes with endothelial cells in angiogenesis dynamics. Stem Cells Dev. 22, 855-865 (2013).
- Nucera, S., Biziato, D., De Palma, M. The interplay between macrophages and angiogenesis in development, tissue injury and regeneration. Int J Dev Biol. 55, 495-503 (2011).
- Joensuu, K., et al. Interaction between marrow-derived human mesenchymal stem cells and peripheral blood mononuclear cells in endothelial cell differentiation. Scand J Surg. 100, 216-222 (2011).
- Takakura, N. Role of intimate interactions between endothelial cells and the surrounding accessory cells in the maturation of blood vessels. J Thromb Haemost. 9 Suppl 1, 144-150 (2011).
- Plantier, L., Boczkowski, J., Crestani, B. Defect of alveolar regeneration in pulmonary emphysema: role of lung fibroblasts. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 2, 463-469 (2007).
- Belair, D. G., Murphy, W. L. Specific VEGF sequestering to biomaterials: influence of serum stability. Acta Biomater. 9, 8823-8831 (2013).
- Wong, C., Inman, E., Spaethe, R., Helgerson, S. Fibrin-based biomaterials to deliver human growth factors. Thromb Haemost. 89, 573-582 (2003).
- Stolzing, A., Colley, H., Scutt, A. Effect of age and diabetes on the response of mesenchymal progenitor cells to fibrin matrices. Int J Biomater. 2011, 378034 (2011).
- Vailhe, B., Ronot, X., Tracqui, P., Usson, Y., Tranqui, L. In vitro angiogenesis is modulated by the mechanical properties of fibrin gels and is related to alpha(v)beta3 integrin localization. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 33, 763-773 (1997).
- Kniazeva, E., Kachgal, S., Putnam, A. J. Effects of extracellular matrix density and mesenchymal stem cells on neovascularization in vivo. Tissue Eng Part A. 17, 905-914 (2011).
- Angio, C. T., Maniscalco, W. M. The role of vascular growth factors in hyperoxia-induced injury to the developing lung. Front Biosci. 7, 1609-1623 (2002).
- Kasahara, Y., et al. Inhibition of VEGF receptors causes lung cell apoptosis and emphysema. J Clin Invest. 106, 1311-1319 (2000).
- Owen, C. A. Roles for proteinases in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 3, 253-268 (2008).
- Demedts, I. K., et al. Elevated MMP-12 protein levels in induced sputum from patients with COPD. Thorax. 61, 196-201 (2006).
- Haq, I., et al. Association of MMP-2 polymorphisms with severe and very severe COPD: a case control study of MMPs-1, 9 and 12 in a European population. BMC Med Genet. 11, 7 (2010).
- Mercer, P. F., et al. MMP-9, TIMP-1 and inflammatory cells in sputum from COPD patients during exacerbation. Respir Res. 6, 151 (2005).
- Matute-Bello, G., et al. Essential role of MMP-12 in Fas-induced lung fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 37, 210-221 (2007).
- Sivakumar, P., Gupta, S., Sarkar, S., Sen, S. Upregulation of lysyl oxidase and MMPs during cardiac remodeling in human dilated cardiomyopathy. Mol Cell Biochem. 307, 159-167 (2008).
- Gomperts, B. N., Strieter, R. M. Stem cells and chronic lung disease. Annu Rev Med. 58, 285-298 (2007).
- Lau, A. N., Goodwin, M., Kim, C. F., Weiss, D. J. Stem cells and regenerative medicine in lung biology and diseases. Mol Ther. 20, 1116-1130 (2012).
