Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein’s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.
Centrosomes er små, men viktige organeller som tjener som polene av mitotiske spindel for å opprettholde integriteten genomisk eller montere primære cilia å lette sensoriske funksjoner i celler. Nivået av et protein kan reguleres på en annen måte ved centrosomes enn ved andre .cellular steder, og variasjonen i centrosomal nivået av flere proteiner i forskjellige punkter av cellesyklus synes å være avgjørende for riktig regulering av centriole sammenstilling. Vi har utviklet en kvantitativ fluorescens mikroskopi-analyse som måler relative endringer i nivået for et protein på centrosomes i fikserte celler fra forskjellige prøver, for eksempel ved forskjellige faser av cellesyklusen eller etter behandling med forskjellige reagenser. Prinsippet for denne analyse ligger i å måle bakgrunns korrigert fluorescerende intensitet svarende til et protein ved et lite område, og normal at målingen mot det samme for et annet protein som ikke varierer i henhold til den valgte eksperimentelle condition. Utnytte denne analyse i kombinasjon med BrdU puls og jakt strategi for å studere uaffisert cellesykluser, har vi kvantitativt bekreftet vår siste observasjon at centrosomal pool av VDAC3 reguleres ved centrosomes i løpet av cellesyklusen, sannsynligvis ved proteasom-mediert nedbrytning spesifikt på centrosomes.
Centrosomes består av et par av Sentrioler omgitt av pericentriolar materiale (PCM). Å være de store microtubule organisering sentre (MTOCs) i pattedyrceller, centrosomes tjene som de to poler av mitosetråder i dele celler, og dermed bidra til å opprettholde genomisk integritet en. I hvilende celler (f.eks, under G0 fase), en av de to Sentrioler av sentrosomen, nemlig moder centriole, blir omdannet til en basal organ for å montere den primære cilium, et sensorisk organell stikker ut fra celleoverflaten 2. Når cellene gå inn igjen i cellesyklus, er primære cilier demontert og hver centriole dirigerer montering av en procentriole på sin proksimale ende som gradvis forlenges for å danne en moden centriole tre. Ved inntreden av S-fase, slå hjul-lignende struktur som gir 9-gangers symmetri til centriole dannet på overflaten av hvert eksisterende centriole og vil bli undersiden av hver procentriole. Sas6 thatten er uunnværlig for centriole forsamlingen er rekruttert for å danne navet i Cartwheel 4-6. Andre centriolar proteiner blir deretter satt sammen på Cartwheel i en svært regulert, proksimale til distale måte 7. Etter nettopp fullført centriole duplisering, celler montere ekstra pericentriolar materialer for å bygge to funksjonelle centrosomes innen utgangen av G2 fase 8. I tillegg til kjerne centriolar komponenter 9-11, flere andre proteiner inkludert kinaser, fosfataser, anstand, stillaskomponenter, membran tilhørende proteiner og degradering maskiner er forbundet med Sentrioler, basal organer og PCM på ulike tider av cellesyklus 12-16. Det er ofte bemerkes at centrosomal nivåer av mange proteiner er temporært regulert av centrosomal målretting mekanismer og / eller proteasomal nedbrytning ved centrosomes. Viktigere svingningene i centrosomal nivået av flere proteiner som Plk4, Mps1, Sas6, og en CP110t ulike punkter i cellesyklusen ser ut til å være avgjørende for å regulere centriole montering 5,17-22, og i tilfelle av Mps1 hindre dette centrosomal degradering fører til dannelsen av overskytende Sentrioler 19. På den annen side, centrosomal fraksjoner av flere proteiner er mindre labile sammenlignet cytosoliske bassenger. For eksempel siRNA-mediert nedregulering av Centrin 2 (Cetn2) førte til bare en moderat reduksjon av proteinnivå på Sentrioler tross for stor reduksjon i dets hele cellenivåer 23. Det er derfor viktig å måle endringer i nivået av centrosomal proteinene på sentrosomen heller enn å måle hele celle protein nivåer ved vurdering av deres sentrosomen spesifikke funksjoner.
I denne studien har vi utviklet en analyse ved hjelp av indirekte immunfluorescens (IIF) for å kvantifisere den relative nivået av et protein ved centrosomes. Denne analysen er utviklet spesielt for å analysere celler som er fra forskjellige prøverog dermed ikke kan avbildes på samme tid. Disse prøvene kan være celler som ble behandlet med forskjellige reagenser (dvs. medikament versus kontroll), samlet ved forskjellige tidspunkter (dvs. puls versus chase), eller er i forskjellige faser av cellesyklusen. Prinsippet for denne analyse ligger i å måle bakgrunns korrigert fluorescerende intensitet svarende til et protein ved et lite område, og for å normalisere den verdi mot det samme for et annet protein som har nivåer ikke varierer i henhold til de valgte forsøksbetingelser. Flere studier i sentrosomen biologi har nylig benyttet ulike kvantitative mikroskopi teknikker, både levende eller faste celler, for å fastslå sentrosomen-spesifikk funksjon av kandidat proteiner 24-27. I likhet med disse assays, den foreliggende teknikk måler også bakgrunnen korrigert fluorescensintensitet av testprotein. Imidlertid vil inkludering av normalisering ved hjelp av en intern standard i denne analysen sannsynligvis gi størrenøyaktighet og trygghet i å analysere to forskjellige prøver som er på to forskjellige dekkglass. Videre, i tillegg til å undersøke protein-nivå på centrosomes, med mindre justeringer av denne metoden kan anvendes på et variert sett av eksperimentelle betingelser, eller ved andre cellulære områder.
Her kombinerer vi vår kvantitative mikros analysen med en BrdU puls-chase strategi for å sammenligne celler fra ulike cellesyklus stadier. Istedenfor å bruke standard cellesyklus-stans og frigjørings teknikker for å studere forskjellige cellesyklus tidspunkter, asynkront voksende celler blir inkubert med BrdU å merke celler i S-fasen, og de merkede celler blir jaget i forskjellige tidsrom (typisk 4-6 timer). De fleste av de merkede celler vil være i S-fase umiddelbart etter pulsen. Lengden på jakten er valgt slik at etter jakten, vil merkede celler være i slutten av S, G2, eller mitose, som kan bekreftes av morfologiske egenskaper som- posisjon av centrosomes med hensyn til nucLei, avstanden mellom centrosomes, kondensasjon av kromosomer etc. Således vil lengden av chase avhenger av den gjennomsnittlige varigheten av S, G2 og M-fasen av en bestemt celletype. Siden denne fremgangsmåten unngår cellesyklus inhibitorer så som hydroksyurea, aphidicholin, nocodazol, etc., gjør det til en mer fysiologisk relevant cellesyklusanalyse.
Således, viser vi her at den kvantitative fluorescensmikroskopi assay alene, eller i kombinasjon med BrdU puls-chase-analysen, er et enkelt, men kraftig teknikk for nøyaktig å måle de relative endringer i centrosomal nivået av en kandidatprotein under en uforstyrret cellesyklusen. Vi målte centrosomal nivå VDAC3, et protein som vi nylig identifisert på centrosomes i tillegg til mitokondriene 16,28, ved hjelp av disse analysene. Resultater oppnådd her bekrefte vår forrige observasjon at centrosomal pool av VDAC3 er regulert av degradering, og varierer også i en cellesyklus dependent 16 måte, dessuten å validere anvendelse av denne metoden.
Kvantitativ mikros i cellebiologi er vanligvis forbundet med levende cellebildeanalyser som fluorescens Resonance Energy Transfer (FRET), Fluorescens Recovery Etter fotobleking (FRAP), etc. Men det er økende eksempler på cellebiologer utviklings ulike kvantitative mikros analyser for fast celler i de senere år 27,34-36. Viktigere, fremgang i forståelsen sentrosomen biologi ofte krever forståelse av sentrosomen-spesifikk funksjon av proteiner som centrosomal bassenger kan være regulert annerlede…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a National Institutes of Health grant (GM77311) and a seed grant from The Ohio Cancer Research Associates (to H.A.F.). SM was partially supported by an Up on the Roof fellowship from the Human Cancer Genetics Program of The Ohio State University Comprehensive Cancer Center.
Name | Company | Catalog number | Comments |
Fibronectin | Sigma | F8141 | Stock of 1 mg/ml in water |
DMSO | Sigma | D2650 | |
MG115 | Sigma | SCP0005 | Stock of 10 mM in DMSO |
BrdU | Sigma | B5002 | Stock of 10 mM in DMSO |
Anti-g-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88) | Sigma | T 6557 | 1:200 in IIF blocking buffer |
Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal) | Aviva Systems Biology | ARP35180-P050 | 1:50 in IIF blocking buffer, 1:1000 in WB blocking buffer |
Anti-Sas6 (mouse monoclonal) | Santa cruz biotechnology | sc-81431 | 1:100 in IIF blocking buffer |
Anti-Cep135 (rabbit polyclonal) | Abcam | ab-75005 | 1:500 in IIF blocking buffer |
Anti-BrdU (rat monoclonal) | Abcam | ab6326 | 1:250 in IIF blocking buffer |
Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life technologies | A21093 | 1:200 in IIF blocking buffer |
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21202 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21203 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21206 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21207 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
Anti-g-tubulin (rabbit polyclonal) | Sigma | T5192 | 1:1000 in WB blocking buffer |
Anti-a-tubulin (mouse monoclonal, DM1A) | Sigma | T9026 | 1:20000 in WB blocking buffer |
Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A10043 | 1:10000 in WB blocking buffer |
Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW Conjugated | Rockland antibodies | 610-731-002 | 1:10000 in WB blocking buffer |
SlowFade Gold Antifade Reagent | Life technologies | S36936 | Mounting media |
Round coverslips 12CIR.-1 | Fisherbrand | 12-545-80 | |
Olympus IX-81 microscope | Olympus | ||
Retiga ExiFAST 1394 IR camera | QImaging | 32-0082B-238 | |
100X Plan Apo oil immersion objective | Olympus | 1.4 numerical aperture | |
Slidebook software package | Intelligent Imaging Innovations | ||
Odyssey IR Imaging System | Li-cor Biosciences | ||
Bicinchoninic acid (BCA) assay | Thermo Scientific | 23227 | |
U-MNU2 Narrow UV cube | Olympus | U-M622 | Filter |
U-MNU2 Narrow Blue cube | Olympus | U-M643 | Filter |
U-MNU2 Narrow Green cube | Olympus | U-M663 | Filter |