Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein’s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.
Centrossomas são pequenas, mas importantes organelas que servem como os pólos do fuso mitótico para manter a integridade genômica ou montar cílios para facilitar funções sensoriais nas células. O nível de uma proteína pode ser regulado de forma diferente em centrossomas do que em outros locais .cellular, e a variação no nível centrosomal de várias proteínas em diferentes pontos do ciclo celular parece ser crucial para a regulação correcta da montagem centriole. Foi desenvolvido um ensaio de microscopia de fluorescência quantitativa que mede as mudanças relativas no nível de uma proteína na centrossomas em células fixadas a partir de diferentes amostras, tais como em diferentes fases do ciclo celular, ou após tratamento com vários reagentes. O princípio deste ensaio encontra-se na medição da intensidade de fluorescência de fundo corrigido correspondente a uma proteína com uma pequena região, e que normalizar medição contra o mesmo para uma outra proteína que não varia no âmbito do c experimental escolhidoondition. Utilizando este ensaio, em combinação com BrdU de pulso e caça estratégia para estudar os ciclos celulares não perturbados, temos quantitativamente validado nossa observação recente de que o conjunto de centrosomal VDAC3 é regulada a centrossomas durante o ciclo celular, provavelmente pela degradação mediada por proteassoma especificamente em centrossomas.
Centrossomas consistem em um par de centríolos cercados por material de pericentriolar (PCM). Sendo os principais centros de microtúbulos organizadoras (MTOCs) em células de mamíferos, centrosomes servem como os dois pólos de fusos mitóticos em células em divisão, e, assim, ajudar a manter a integridade genômica 1. Em células quiescentes (por exemplo, durante a fase G0), um dos dois centrioles do centrossoma, a saber, a centriole mãe, é transformado em um corpo de base, ao montar o cílio primário, um organelo sensorial salientes para fora a partir da superfície de células 2. Uma vez que as células re-entrar no ciclo celular, os cílios são desmontados e cada centriole dirige a montagem de um procentriole na sua extremidade proximal que, gradualmente, se alonga para formar um centriole 3 madura. No início da fase S, uma estrutura semelhante a cambalhota que fornece a simetria de 9 vezes para a centriole é formada sobre a superfície de cada centriole existente e irá tornar-se a base de cada procentriole. SAS6 tchapéu é indispensável para a montagem centríolo é recrutado para formar o cubo da roda de carroça 4-6. Outras proteínas centriolar são então montados para a cambalhota em um ambiente altamente regulado, proximal para distal maneira 7. Depois de completar precisamente duplicação centríolo, células montar materiais pericentriolar adicionais para construir dois centrossomas funcionais até o final da fase G2 8. Em adição aos componentes principais centriolar 9-11, várias outras proteínas, incluindo cinases, fosfatases, chaperones, componentes de andaime, proteínas de membrana associadas a degradação e máquinas estão associados com centrioles, corpos basais e PCM em alturas diferentes do ciclo celular 12-16. Ele é frequentemente observado que os níveis de centrosomal muitas proteínas são temporalmente regulados por mecanismos de segmentação centrosomal e / ou degradação no proteossómica centrossomas. É importante ressaltar que as flutuações no nível centrosomal de várias proteínas, como Plk4, MPS1, SAS6 e CP110 umt diferentes pontos do ciclo celular parece ser crucial para regular montagem centriole 5,17-22, e no caso de MPS1 prevenir essa degradação centrosomal leva à formação de um excesso de 19 centrioles. Por outro lado, as fracções centrosomal de várias proteínas são menos lábeis em relação a piscinas citosólicas. Por exemplo siRNA mediada down-regulação da Centrin 2 (Cetn2) levou a apenas uma diminuição moderada do nível de proteína nas centrioles apesar de grande redução em toda a sua níveis de células 23. É, portanto, essencial para medir as mudanças no nível de proteínas centrosomal no centrosome em vez de medir os níveis de proteínas inteiras celular ao avaliar suas funções específicas do centrossoma.
Neste estudo foi desenvolvido um ensaio utilizando imunofluorescência indireta (IFI) para quantificar o nível relativo de uma proteína no centrosomes. Este ensaio é desenvolvido particularmente para analisar as células que são a partir de diferentes amostrase, portanto, não pode ser trabalhada ao mesmo tempo. Estas amostras podem ser células que foram tratadas com diferentes reagentes (isto é, a droga versus controlo), recolhidas a diferentes pontos de tempo (isto é, contra perseguição de impulso), ou estão em diferentes fases do ciclo celular. O princípio deste ensaio encontra-se na medição da intensidade de fluorescência de fundo corrigido correspondente a uma proteína com uma região pequena e para normalizar o valor contra o mesmo para uma outra proteína cujos níveis não variam de acordo com as condições experimentais escolhidas. Vários estudos em biologia do centrossoma recentemente utilizados várias técnicas de microscopia quantitativa, em ambas as células vivas ou fixadas, para determinar a função específica do centrossoma de proteínas candidatas 24-27. Semelhante aos ensaios, a presente técnica também mede a intensidade de fluorescência de fundo corrigido da proteína a testar. No entanto, a inclusão da normalização utilizando um padrão interno no presente ensaio seria provável oferecer maiorprecisão e confiança na análise de duas amostras diferentes que estão em duas lamelas diferentes. Além disso, em adição ao exame do nível de proteína no centrossomas, com pequenos ajustes este método pode ser aplicado a um conjunto diversificado de condições experimentais ou em outros locais celulares.
Aqui, nós combinamos nosso ensaio microscopia quantitativa, com uma estratégia de pulso-chase BrdU para comparar as células de diferentes fases do ciclo celular. Em vez de utilizar técnicas de paragem do ciclo celular e padrão de libertação para o estudo de vários pontos de tempo do ciclo celular, as células que crescem de forma assíncrona são incubadas com BrdU para marcar as células em fase S, e as células marcadas são perseguidos durante vários tempos (tipicamente 4-6 h). A maioria das células marcadas estará em fase S imediatamente após o pulso. O comprimento da perseguição é escolhida de modo que após a perseguição, células marcadas será no final de S, G2 ou mitose, o que pode ser verificado por características morfológicas, tais como- posição de centrossomas no que diz respeito ao nuclei, a distância entre os centrossomas, condensação de cromossomas, etc. Assim, o comprimento da perseguição depende da duração média de S, G2 e M de fase num tipo de célula particular. Uma vez que esta abordagem evita a inibidores do ciclo celular, tais como a hidroxiureia, a afidicolina, nocodazol, etc, que permite uma análise mais fisiologicamente relevante do ciclo celular.
Assim, demonstramos aqui que o ensaio de microscopia de fluorescência quantitativa sozinho, ou em combinação com BrdU de pulso-caça ensaio, é uma técnica simples e poderosa para medir com precisão as mudanças relativas no nível centrosomal de uma proteína candidata durante um ciclo celular perturbado. Foi medido o nível de centrosomal VDAC3, uma proteína que, recentemente identificado em centrossomas além de mitocôndrias 16,28, utilizando estes ensaios. Os resultados obtidos aqui verificar a nossa observação anterior de que a piscina centrosomal de VDAC3 é regulada pela degradação, e também varia em um dependen ciclo celulart modo 16, além disso validando a aplicabilidade deste método.
Microscopia quantitativa em biologia celular é comumente associado com ensaios de imagem em células vivas, como a fluorescência de Ressonância Energia Transferência (FRET), Recuperação de fluorescência Após Fotodegradação (FRAP), etc. No entanto, há exemplos de crescimento de biólogos celulares em desenvolvimento diferentes ensaios de microscopia quantitativos para fixo células nos últimos anos 27,34-36. É importante ressaltar que o progresso na compreensão da biologia centrosome mui…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a National Institutes of Health grant (GM77311) and a seed grant from The Ohio Cancer Research Associates (to H.A.F.). SM was partially supported by an Up on the Roof fellowship from the Human Cancer Genetics Program of The Ohio State University Comprehensive Cancer Center.
Name | Company | Catalog number | Comments |
Fibronectin | Sigma | F8141 | Stock of 1 mg/ml in water |
DMSO | Sigma | D2650 | |
MG115 | Sigma | SCP0005 | Stock of 10 mM in DMSO |
BrdU | Sigma | B5002 | Stock of 10 mM in DMSO |
Anti-g-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88) | Sigma | T 6557 | 1:200 in IIF blocking buffer |
Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal) | Aviva Systems Biology | ARP35180-P050 | 1:50 in IIF blocking buffer, 1:1000 in WB blocking buffer |
Anti-Sas6 (mouse monoclonal) | Santa cruz biotechnology | sc-81431 | 1:100 in IIF blocking buffer |
Anti-Cep135 (rabbit polyclonal) | Abcam | ab-75005 | 1:500 in IIF blocking buffer |
Anti-BrdU (rat monoclonal) | Abcam | ab6326 | 1:250 in IIF blocking buffer |
Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life technologies | A21093 | 1:200 in IIF blocking buffer |
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21202 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21203 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21206 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21207 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
Anti-g-tubulin (rabbit polyclonal) | Sigma | T5192 | 1:1000 in WB blocking buffer |
Anti-a-tubulin (mouse monoclonal, DM1A) | Sigma | T9026 | 1:20000 in WB blocking buffer |
Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A10043 | 1:10000 in WB blocking buffer |
Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW Conjugated | Rockland antibodies | 610-731-002 | 1:10000 in WB blocking buffer |
SlowFade Gold Antifade Reagent | Life technologies | S36936 | Mounting media |
Round coverslips 12CIR.-1 | Fisherbrand | 12-545-80 | |
Olympus IX-81 microscope | Olympus | ||
Retiga ExiFAST 1394 IR camera | QImaging | 32-0082B-238 | |
100X Plan Apo oil immersion objective | Olympus | 1.4 numerical aperture | |
Slidebook software package | Intelligent Imaging Innovations | ||
Odyssey IR Imaging System | Li-cor Biosciences | ||
Bicinchoninic acid (BCA) assay | Thermo Scientific | 23227 | |
U-MNU2 Narrow UV cube | Olympus | U-M622 | Filter |
U-MNU2 Narrow Blue cube | Olympus | U-M643 | Filter |
U-MNU2 Narrow Green cube | Olympus | U-M663 | Filter |