Kvantitativ Immunofluorescens analys för att mäta variationen i proteinnivåer vid Centrosomes

Summary

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein’s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Abstract

Centrosomes är små men viktiga organeller som fungerar som poler mitotiska spindeln för att bibehålla genomisk integritet eller montera primära cilier att underlätta sensoriska funktioner i celler. Nivån för ett protein kan regleras på olika sätt vid centrosomes än vid andra .cellular platser, och variationen i centrosomal nivån av flera proteiner vid olika punkter i cellcykeln verkar vara avgörande för en korrekt reglering av Centriol montering. Vi utvecklade en kvantitativ fluorescensmikroskopi analys som mäter relativa förändringar i nivån av ett protein vid centrosomes i anläggningstillgångar celler från olika prover, såsom vid olika faser av cellcykeln eller efter behandling med olika reagens. Principen för denna analys ligger i att mäta bakgrundskorrigerade fluorescerande intensitet motsvarande ett protein på ett litet område, och normalisera att mätning mot samma för ett annat protein som inte varierar under valda experimentella condition. Med användning av denna analys i kombination med BrdU puls och chase strategi för att studera ostörda cellcykler, har vi kvantitativt validerat vår senaste observationen att centrosomal pool av VDAC3 regleras på centrosomes under cellcykeln, sannolikt genom proteasom-förmedlad nedbrytning specifikt på centrosomes.

Introduction

Centrosomes består av ett par av centrioler omgivna av pericentriolar material (PCM). Att de stora mikrotubuli organiseringscentrum (MTOCs) i däggdjursceller, centrosomes fungera som två poler mitotiska spindlar i delande celler, och därmed bidra till att upprätthålla genomisk integritet ^1. I vilande celler (t.ex. under G0 fas), en av de två centrioler av Centrosom, nämligen moder Centriol, transformeras till en basal kropps att montera den primära cilium, en sensorisk organell utskjutande ut från cellytan ^2. När cellerna åter in i cellcykeln, är primära cilier isär och varje Centriol dirigerar monteringen av en procentriole vid dess proximala ände som gradvis förlängs för att bilda en mogen Centriol ^3. Vid början av S-fasen, är en kärrhjulsluster liknande struktur som ger den 9-faldig symmetri till Centriol bildats på ytan av varje befintlig Centriol och kommer att bli basen av varje procentriole. Sas6 thatt är oumbärlig för Centriol aggregatet rekryteras för att bilda navet i kärrhjulsluster ^4-6. Andra centriolar proteiner monteras sedan på kärrhjul i en starkt reglerad, proximalt distala sätt ^7. Efter exakt avslutat Centriol duplicering, celler montera ytterligare pericentriolar material för att bygga två funktionella centrosomes i slutet av G2-fasen ^8. Utöver kärn centriolar komponenterna ^9-11, flera andra proteiner inklusive kinaser, fosfataser, chaperones, ställningskomponenter, membran associerade proteiner och maskiner nedbrytningen är förknippade med centrioler, basala organ och PCM vid olika tider på cellcykeln ^12-16. Det är ofta noteras att centrosomal nivåerna av många proteiner tidsmässigt regleras av centrosomal inriktningsmekanismer och / eller proteasomal nedbrytning vid centrosomes. Viktigt svängningarna i centrosomal nivån av flera proteiner såsom Plk4, Mps1, Sas6 och CP110 at olika punkter av cellcykeln tycks vara avgörande för att reglera Centriol montering ^5,17-22, och i fallet med Mps1 förhindra detta centrosomal nedbrytning leder till bildandet av överskott centrioler ^19. Å andra sidan, de centrosomal fraktioner av flera proteiner är mindre labila än cytosoliska pooler. Exempelvis siRNA-medierad nedreglering av Centrin 2 (Cetn2) ledde endast till en måttlig minskning av proteinet nivå vid centrioler trots stor minskning av dess hela cellnivåer ^23. Därför är det viktigt att mäta förändringar i nivån av centrosomal proteiner vid Centrosom snarare än att mäta hela cellproteinnivåer vid bedömningen sina Centrosom specifika funktioner.

I denna studie har vi utvecklat en analys med hjälp av indirekt immunofluorescens (IIF) för att kvantifiera den relativa nivån av ett protein vid centrosomes. Denna assay har utvecklats särskilt för att analysera celler som är från olika proveroch sålunda inte kan avbildas samtidigt. Dessa prover kan vara celler som behandlats med olika reagenser (dvs läkemedel mot kontroll), insamlade vid olika tidpunkter (dvs puls kontra chase), eller är i olika faser av cellcykeln. Principen för denna analys ligger i att mäta bakgrunden korrigerade fluorescensintensiteten som motsvarar ett protein på ett litet område och att normalisera detta värde mot densamma för ett annat protein vars nivåer inte varierar under de valda försöksbetingelserna. Flera studier i Centrosom biologin har nyligen utnyttjat olika kvantitativa mikroskopitekniker, i båda levande eller fixerade celler, för att bestämma Centrosom specifika funktion kandidatproteiner ^24-27. Liknar dessa analyser, föreliggande teknik mäter också bakgrundskorrigerad fluorescensintensiteten hos testproteinet. Dock skulle införandet av normalisering med en intern standard i denna analys sannolikt erbjuda störrenoggrannhet och självförtroende i att analysera två olika prover som är på två olika täck. Dessutom, förutom att undersöka proteinnivån vid centrosomes, med mindre justeringar denna metod kan tillämpas på en mångfald av experimentella betingelser eller vid andra cellulära platser.

Här kombinerar vi vårt kvantitativa mikroskopi analys med en BrdU puls-chase strategi att jämföra celler från olika cellcykelsteg. Istället för att använda standardcellcykelstopp och frisättningstekniker för att studera olika cellcykeltidpunkter, asynkront växande celler inkuberas med BrdU att märka celler i S-fas, och de märkta cellerna jagade under olika tider (vanligtvis 4-6 h). De flesta av de märkta cellerna kommer att vara i S-fas omedelbart efter pulsen. Längden på jakten väljs så att efter jakten, kommer märkta celler att vara i slutet av S, G2, eller mitos, vilket kan verifieras genom morfologiska egenskaper som- ställning för centrosomes avseende nuclei, avståndet mellan centrosomes, kondensation av kromosomer etc. Således längd jakten beror på den genomsnittliga längden på S, G2 och M fasen av en viss celltyp. Eftersom detta tillvägagångssätt undviker cellcykelinhibitorer såsom hydroxiurea, afidikolin, nokodazol, etc., gör det en mer fysiologiskt relevant cellcykelanalys.

Således visar vi här att den kvantitativa fluorescensmikroskopi analys ensamt eller i kombination med BrdU puls-chase-analysen, är en enkel men kraftfull teknik för att noggrant mäta de relativa förändringarna i centrosomal nivån för en kandidat protein under en oberörd cellcykeln. Vi mätte centrosomal nivån VDAC3, ett protein som vi nyligen identifierat vid centrosomes förutom mitokondrier ^16,28, med användning av dessa analyser. Resultat som erhållits här verifiera vår tidigare iakttagelse att centrosomal pool av VDAC3 regleras av nedbrytning, och varierar också i en cellcykel beroendent sätt ^16, dessutom validera tillämpligheten av detta förfarande.

Protocol

1. Cellkultur Använd humant telomeras omvänt transkriptas (hTERT) förevigade retinala pigmentepitelceller (hTERT-RPE1; här kallad RPE1). OBS: RPE1 celler är nära-diploida, icke-transformerade humana celler som vanligen används för att studera Centriol montering och ciliogenesis. Dessa celler följer en normal Centriol dubbelcykel samordnas med en reglerad cellcykeln. Passage en nästan konfluent 100 mm cellodlingsskål av RPE1 celler vid 1: 5 spädning av den ursprungliga kulturen til…

Representative Results

Våra senare studier identifierat nya centrosomal lokalisering och funktion VDAC3, en av de mitokondriella poriner 16,28. Immunfärgning av flera däggdjursceller inklusive RPE1 celler med hjälp av ett VDAC3-specifik antikropp visade framträdande centrosomal färgning och jämförelsevis svaga mitokondriell färgning. Vi visade också att centrosomal VDAC3 är företrädesvis förknippas med modern Centriol och centrosomal pool av både endogena och ectopically uttryckte VDAC3 regleras genom nedbrytning <su…

Discussion

Kvantitativ mikroskopi inom cellbiologi är ofta förknippad med levande cell imaging analyser såsom Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP), etc. Det finns dock växande exempel på cellbiologer utvecklar olika kvantitativa mikroskopi analyser för fast celler i de senaste åren ^27,34-36. Viktigt framsteg i att förstå Centrosom biologin kräver ofta förståelse för Centrosom-specifik funktion av proteiner vars centrosomal pooler kan re…

Materials

Name	Company	Catalog number	Comments
Fibronectin	Sigma	F8141	Stock of 1 mg/ml in water
DMSO	Sigma	D2650
MG115	Sigma	SCP0005	Stock of 10 mM in DMSO
BrdU	Sigma	B5002	Stock of 10 mM in DMSO
Anti-g-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88)	Sigma	T 6557	1:200 in IIF blocking buffer
Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal)	Aviva Systems Biology	ARP35180-P050	1:50 in IIF blocking buffer, 1:1000 in WB blocking buffer
Anti-Sas6 (mouse monoclonal)	Santa cruz biotechnology	sc-81431	1:100 in IIF blocking buffer
Anti-Cep135 (rabbit polyclonal)	Abcam	ab-75005	1:500 in IIF blocking buffer
Anti-BrdU (rat monoclonal)	Abcam	ab6326	1:250 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L)	Life technologies	A21093	1:200 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21202	1:1000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21203	1:1000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21206	1:1000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21207	1:1000 in IIF blocking buffer
Anti-g-tubulin (rabbit polyclonal)	Sigma	T5192	1:1000 in WB blocking buffer
Anti-a-tubulin (mouse monoclonal, DM1A)	Sigma	T9026	1:20000 in WB blocking buffer
Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Life technologies	A10043	1:10000 in WB blocking buffer
Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW Conjugated	Rockland antibodies	610-731-002	1:10000 in WB blocking buffer
SlowFade Gold Antifade Reagent	Life technologies	S36936	Mounting media
Round coverslips 12CIR.-1	Fisherbrand	12-545-80
Olympus IX-81 microscope	Olympus
Retiga ExiFAST 1394 IR camera	QImaging	32-0082B-238
100X Plan Apo oil immersion objective	Olympus		1.4 numerical aperture
Slidebook software package	Intelligent Imaging Innovations
Odyssey IR Imaging System	Li-cor Biosciences
Bicinchoninic acid (BCA) assay	Thermo Scientific	23227
U-MNU2 Narrow UV cube	Olympus	U-M622	Filter
U-MNU2 Narrow Blue cube	Olympus	U-M643	Filter
U-MNU2 Narrow Green cube	Olympus	U-M663	Filter