Toksikologiske Analyser for Testing Virkninger av en epigenetisk Drug på Development, Fruktbarhet og overlevelses av malariamygg

Summary

A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.

Abstract

Insekticid motstand utgjør et stort problem for malaria kontrollprogrammer. Mygg tilpasse seg til et bredt område av endringer i miljøet raskt, noe som gjør malaria styre et allestedsnærværende problem i tropiske land. Fremveksten av insektmiddel resistente populasjoner garanterer utforskning av nye medikament målet trasé og forbindelser for vektor mygg kontroll. Epigenetiske narkotika er godt etablert i kreftforskning, men ikke mye er kjent om deres virkninger på insekter. Denne studien gir en enkel protokoll for å undersøke de toksikologiske effekter av 3-Deazaneplanocin A (DZNep), en eksperimentell epigenetisk narkotika for kreftbehandling, på malaria vektor, Anopheles gambiae. En konsentrasjonsavhengig økning i dødelighet og reduksjon i størrelse ble observert hos umodne mygg utsatt for DZNep, mens forbindelsen reduseres fruktbarheten hos voksne mygg i forhold til kontrollbehandlinger. I tillegg var det en medikamentavhengig reduksjon i S -adenosylhomocystein (SAH) hydrolaseaktivitet i mygg etter eksponering for DZNep forhold til å kontrollere behandlinger. Disse protokollene gi forskeren med en enkel, steg-for-trinn prosedyre for å vurdere flere toksikologiske endepunkter for et eksperimentelt medikament og i sin tur viser en unik multi-spiss tilnærming for å utforske de toksikologiske effekter av vannløselige epigenetiske legemidler eller forbindelser av interesse mot vektor mygg og andre insekter.

Introduction

Malaria er ansvarlig for det høyeste antallet insektrelaterte dødsfall i verden. Anslagsvis 219 millioner tilfeller forekommer årlig på verdensbasis, noe som resulterer i ca 660 000 dødsfall, hovedsakelig i Afrika ^en. Til tross for felles innsats, malariaprogrammer møter en rekke utfordringer. Mens insekt behandlet myggnett og innendørs rest sprøyting skjema sentrale deler av programmet, motstand mot insektmidler i lokale bestander hindre dette arbeidet ^to. Den raske økningen i insektmiddel resistente myggbestanden er i stor grad tilskrives evnen til malariamygg for å tilpasse seg raskt til endringer i deres miljø og utnytte ulike nisjer ^3,4,5. For å overvinne de eksisterende mekanismene for insektmiddel motstand, er utforskning av nye insektmiddel mål og neste generasjons forbindelser garantert. En enkel, steg-for-steg-protokoll for å fastslå effekten av eksperimentelle insektmidler på de ulike livsstadier av malaria mosquitoes vil i betydelig grad styrke dette arbeidet.

Farmakologiske studier av narkotika effekter på cellelinjer og dyremodeller har etablert bruk av epigenetiske narkotika som et nyttig verktøy for å modulere genetikk og fysiologi av celler og organismer. DNA metylering og histon modifikasjon er to epigenetiske mekanismer som påvirker genekspresjon i flercellede organismer uten å endre den underliggende DNA sekvens ^6. Innlegg translasjonelle modifikasjoner som metylering spille en avgjørende rolle i å opprettholde cellular integritet og genuttrykk, og kan påvirke flere fundamentale prosesser ^7,8,9. Forskning i noen insektarter har understreket betydningen av epigenetikk i prosesser som involverer oogenesen og stamcelle vedlikehold ^10, samt dosering kompensasjon ^11. Men slike aspekter i sykdoms vektorer er ennå å bli utforsket. Ved hjelp av en forbindelse til å modulere dette systemet på mygg kan gi oss iseverdighetene i romanen insektmiddel målet veier. 3-Deazaneplanocin A (DZNep) er en kjent histone metylering hemmer, som innvirkning på ulike typer kreft har blitt studert ^{12,13,14,15,16.} DZNep er en stabil vannløselig epigenetisk medikament som hemmer indirekte histon lysin N-metyltransferase (EZH2), en komponent av polycomb undertrykkende komplekset 2 (PRC2) i pattedyrceller. PRC2 spiller en viktig rolle i å regulere veksten av stamceller i flercellede organismer, og histon metylering er en sentral del av PRC2 mediert genet demping. Hos immunkompromitterte mus, har cellene forbehandlet med DZNep vist seg å være mindre tumorigen ^17. Dette stoffet blir brukt til å studere andre sykdommer, slik som ikke-alkoholisk fettleversykdom, hvori EZH2 er implisert ^18. DZNep er en etablert S -adenosylhomocysteine ​​(SAH) hydrolaseinhibitor ^{19, 20.} Inhibering av SAH-hydrolase resulterer i enakkumulering av SAH og i sin tur fører til hemming av metyltransferase-aktivitet ved å begrense tilgjengelige metyl donorgrupper. SAH er en aminosyre-derivat benyttes av mange organismer, inklusive insekter, i deres metabolske veier. En fersk studie har vist at DZNep i lave doser kan påvirke Diapause og forsinke utviklingen i insekter ^21.

Her blir en robust protokoll for å undersøke virkningene av en vannoppløselig forbindelse på ulike stadier av mygg utviklet. De tre deler av denne protokollen omfatter instruksjoner for å undersøke virkningene av en vannoppløselig forbindelse på umodne mygg, voksen blodforing hunner, og enzymaktiviteten av voksne mannlige og kvinnelige mygg. Først blir DZNep oppløst i vann for å studere umodne mygg utvikling og overlevelse. Dette er utført ved to konsentrasjoner å sammenligne eventuelle forskjeller som oppstår fra 10-ganger økning i legemiddeleksponering. Å utforske effekten av narkotika på voksen hunnmyggen, DZNeplegges til defibrillert saueblod og matet blod kunstig til kvinner. Deretter blir resultatet av stoffet på fruktbarhet undersøkt. Til slutt blir en enzymaktivitetsanalysen utføres ved hjelp av 5,5'-dithiobis- (2-nitrobenzosyre) (DTNB) som en indikator for å bestemme effekten av DZNep på SAH-hydrolase inhibering i voksne mannlige og kvinnelige mygg. Mens denne protokollen er utviklet med en malariamyggen, Anopheles gambiae, kan den lett tilpasses til å studere effektene av forbindelser av interesse på noen arter av mygg eller andre insekter. Teknikkene beskrevet i denne protokollen kan ikke effektivt anvendes på et stoff med begrenset eller ingen løselighet i vann eller vandige media.

Protocol

MERK: De tre deler av protokollen beskriver vandige eksponering av DZNep medikament til larve mygg, en blodbasert eksponering av DZNep til voksne hunner for å studere effekten av fruktbarhet, og SAH-hydrolase-hemming DZNep målt ved bruk av en enkel kolorimetrisk teknikk. En skjematisk fremstilling av disse analysene er vist i figur 1. 1. Umodne Mosquito Utvikling og survivor Analyser MERK: Denne delen forklarer bruken av et vannløselig stoff som…

Representative Results

Figur 1 er en skjematisk representasjon av analysene; den beskriver de ulike stegene i prosedyren oppført i denne artikkelen. Som protokollen er basert på forskjellige stadier av mygg, er det ingen bestemt sekvens som skal følges for eksperimentene som er beskrevet her. Brukeren kan velge å utføre en eller flere tester samtidig, avhengig av prøve tilgjengelighet. Figur 2 viser platen satt opp for umodne mygg utvikling og survivor analyser. Antal…

Discussion

Det er flere trinn som er avgjørende for vellykket bruk av denne protokollen. For larve analysen, bør man sørge for å riktig merke og kopiere hver forsøkskonsentrasjon. Randomisering testprøver og tilsetning av den angitte mengde av medikament til respektive testbrønner utgjør en viktig del av denne eksperimentelle oppstilling. Før du legger til ^2. stadium mygglarver til en 96-brønns mikroplate, kan hver larve bli satt på et papirhåndkle for 2-3 sek for å fjerne overflødig vann. For å hindre ut…

Materials

Name of the Reagent/Equipment	Company	Catalgue Number	Comments
96-well microplate	Fisher Scientific	12565561
Cell culture plate	CytoOne	CC7682-7506
Centrifuge	Sorvall Fresco	76003758	A different centrifuge can be used
Colored tape rolls	Fisher	S68134
Dissection microscope	Olympus	SZ
DTNB	Sigma Aldrich	D8130
DZNep.HCl	Sigma Aldrich	SMLO305
Egg dish cups
Filter papers	Fisher	09-795E
Glass feeders	Virginia Tech
Glass tissue homogenizer
Heating element	Fisher Scientific	NC0520091
Incubator	Percival scientific	I36VLC8	A different incubator can be used
Microcentrifuge tube,  2 ml	Axygen	22-283
Microcentrifuge tube, 1.5 ml	Axygen	MCT-150-C
Micropipette	Eppendorf	4910 000.069
Na2HPO4	Fisher Scientific	M-3154
NaH2PO4	Fisher Scientific	M-8643
pH meter	Mettler Toledo 7easy	S20
Plate reader	Spectramax	M2
SAH	Sigma Aldrich	A9384	store at -20C
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787