اشتقاق خلايا القلب السلف من الخلايا الجذعية الجنينية
Summary
In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.
Abstract
Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.
Introduction
لا تزال أمراض القلب السبب الرئيسي في العالم اليوم، وظلت معدلات الوفاة دون تغيير تقريبا في العقدين الماضيين (جمعية القلب الأمريكية). وهناك حاجة ماسة لوضع استراتيجيات علاجية جديدة لمنع بشكل فعال أو عكس فشل القلب. واحد استراتيجية واعدة هي العلاج القائم على الخلايا بعد التطور السريع للخلايا الجذعية علم الأحياء 1. وفي هذا الصدد، يمكن أن تكلفة النقرة متعددة القدرات تكون مصدرا ممتازا للخلية العلاج نظرا لقدرتها على التكاثر ولكن ملتزمة فقط إلى القلب النسب التمايز. لذلك، طريقة فعالة وقوية لتوليد وعزل تكلفة النقرة هو من أهمية كبيرة للدراسات العلاج بالخلايا القلب.
يركز هذا البروتوكول على تكلفة النقرة الجنينية التي تم تحديدها خلال مرحلة التطور الجنيني المبكر وكيفية توليدها من المجالس الاقتصادية والاجتماعية. تم عزلها تكلفة النقرة مختلفة من قلوب الجنينية والكبار، حتى من الكوسا العظام 2. أثناء تطور الجنين، morphoge العظامالبروتينات المغنطيسية (أفضل الممارسات الإدارية)، من نوع مجنح أفراد الأسرة الموقع التكامل MMTV (Wnts) وإشارات العقدية لحث التزام Mesp1 + الأديم المتوسط متعددة القدرات 3. Mesp1 + خلايا ثم تفرق في تكلفة النقرة الجنينية 4. وعادة ما يتم وضع علامة هذه تكلفة النقرة التي كتبها HCN4، NK2 علبة مثلية 5 (Nkx2-5)، Isl لLIM علبة مثلية 1 (Isl1)، T-مربع 5 (Tbx5)، والعضلية عامل محسن 2C (Mef2c)، تشكل الحقول القلب الابتدائية والثانية، و المساهمة في أجزاء كبيرة من القلب أثناء تخلق القلب 5-10. كلا Nkx2-5 + وIsl1 + / Mef2c + تكلفة النقرة قادرة على التمايز إلى العضلية، والخلايا العضلات الملساء (SMCS)، والخلايا البطانية 5-8. وبالتالي هذه تكلفة النقرة سوف تؤدي إلى الأوعية الدموية في القلب وكذلك أنسجة القلب وهم مصدر خلية مثالية لعلاج القلب خلية القاعدة. ونتيجة لذلك، كان توليد تكلفة النقرة في المختبر وتركيز البحث رئيسيا في الدراسات القلب والأوعية الدموية. منذ المجالس الاقتصادية والاجتماعية لها التوسع غير المحدود قدرةالثانية تمثل الخلايا ICM في مرحلة الكيسة الأريمية، ويعتبر التفريق بين المجالس الاقتصادية والاجتماعية في تكلفة النقرة الجنينية بعد مرحلة التطور الجنيني الطبيعي نهج منطقي وفعال للحصول على تكلفة النقرة.
نهج واحد التطبيقية على نطاق واسع للحصول على تكلفة النقرة من المجالس الاقتصادية والاجتماعية هو تجميع المجالس الاقتصادية والاجتماعية في EBS 11. لتحسين كفاءة التفريق، وقد استخدمت العوامل الكيميائية ونمو محددة على أساس المعرفة للتنمية القلب 12-14. ومع ذلك، لا توجد علامات جنة البرنامج والتنسيق نهائية، لا سيما لا علامات على سطح الخلية، والتي تحظى بقبول واسع في هذا المجال. لمعالجة هذه المسألة، صممت المجالس الاقتصادية والاجتماعية للاحتفال Isl1 + أو Mef2c + تكلفة النقرة ومشتقاتها مع الصحفيين الفلورسنت باستخدام نظام لجنة المساواة العرقية / loxP. وطرقت recombinase لجنة المساواة العرقية في تحت سيطرة Isl1 / Mef2c المروج / محسن. تعديل RFP بروتين فلوري أو YFP الجين يقودها المروج التأسيسي يمكن تفعيلها من خلال استئصال توقف flox كودون مع لجنة المساواة العرقية recombinase(ISL1: لجنة المساواة العرقية، pCAG-flox وقفة وflox-GFP أو طلب تقديم العروض / Isl1-لجنة المساواة العرقية، Rosa26YFP / Mef2c-لجنة المساواة العرقية، Rosa26YFP) 5،6. وحالما يتم التفريق بين المجالس الاقتصادية والاجتماعية في تكلفة النقرة الحقل القلب الثانية، سوف Isl1 / Mef2c المروج / محسن لجنة المساواة العرقية مدفوعة تفعيل صحفيين الفلورسنت وتكلفة النقرة يمكن تغنى FACS تنقية. لفترة وجيزة، يتم استخدام EB طريقة التجميع لبدء ESC التمايز. لتعزيز كفاءة التمايز، ويتم التعامل مع الخلايا المتمايزة مع حمض الاسكوربيك (AA) وعوامل النمو مثل BMP4، Activin ألف وVEGF 13،15. هذا البروتوكول يسمح قوية وذات كفاءة التفريق CPC باستخدام كل من الفأر والمجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان.
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol combines a method using growth factors to guide mESCs differentiation and spontaneous differentiation of human ESCs into CPCs. CPC lineage marked with fluorescent reporter is used to efficiently identify and isolate CPCs by FACS. The FACS-purified CPCs retain the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle, and endothelial cells and have a comparable expression profile to the in vivo cells. Thus, these CPCs can serve as a great resource for cell based heart therapy because of their ability …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Leonid Gnatovskiy for his carefully and critical reading of the paper. This work was supported in part by grants from the National Institutes of Health (HL109054) and the Samuel and Jean Frankel Cardiovascular Center, University of Michigan (Inaugural Fund) to WZ and from the Leon H Charney Division of Cardiology, New York University School of Medicine to BL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| FBS | Thermo scentific | SH30070.03E |
| Knockout SR | Life technology | 10828028 |
| Knockout DMEM | Life technology | 10829018 |
| DMEM | Life technology | 11965118 |
| NEAA | Life technology | 11140050 |
| GlutaMAX | Life technology | 35050061 |
| N2 | Life technology | 17502048 |
| B27 | Life technology | 12587010 |
| Ham’s F12 | Life technology | 11765062 |
| IMDM | Life technology | 12440061 |
| Pen/Strep | Life technology | 15140122 |
| Pyruvate | Life technology | 11360070 |
| Dispase | Life technology | 17105041 |
| Stempro-34 | Life technology | 10639011 |
| DMEM/F12 | Life technology | 11330032 |
| BSA | Life technology | 15260037 |
| Trypsin | Life technology | 25200056 |
| Ascobic Acid | Sigma | A5960 |
| 1-Thioglycerol | Sigma | M1753 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 |
| VEGF | R&D | 293-VE |
| Bmp4 | R&D | 314-BP |
| ActivinA | R&D | 338-AC |
| bFgf | R&D | 233-FB |
| Fgf10 | R&D | 345-FG |
| mTeSR | Stemcell technologies | 5850 |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 |
References
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).
- Passier, R., van Laake, L. W., Mummery, C. L. Stem-cell-based therapy and lessons from the heart. Nature. 453 (7193), 322-329 (2008).
- Bondue, A., Blanpain, C. Mesp1: a key regulator of cardiovascular lineage commitment. Circulation Research. 107 (12), 1414-1427 (2010).
- Bondue, A., et al. Mesp1 acts as a master regulator of multipotent cardiovascular progenitor specification. Cell Stem Cell. 3 (1), 69-84 (2008).
- Bu, L., et al. Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages. Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).
- Lei, I., Gao, X., Sham, M. H., Wang, Z. SWI/SNF protein component BAF250a regulates cardiac progenitor cell differentiation by modulating chromatin accessibility during second heart field development. The Journal of Biological Chemistry. 287 (29), 24255-24262 (2012).
- Lei, I., Liu, L., Sham, M. H., Wang, Z. SWI/SNF in cardiac progenitor cell differentiation. Journal of Cellular Biochemistry. 114 (11), 2437-2445 (2013).
- Wu, S. M., et al. Developmental origin of a bipotential myocardial and smooth muscle cell precursor in the mammalian heart. Cell. 127 (6), 1137-1150 (2006).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field. Developmental Biology. 287 (1), 134-145 (2005).
- Boheler, K. R., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes. Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).
- Wada, R., et al. Induction of human cardiomyocyte-like cells from fibroblasts by defined factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12667-12672 (2013).
- Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Takahashi, T., et al. Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes. Circulation. 107 (14), 1912-1916 (2003).
- Wamstad, J. A., et al. Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage. Cell. 151 (1), 206-220 (2012).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Gaj, T., Gersbach, C. S., Barbas, T. A. L. E. N. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
- Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature. biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PloS One. 6 (4), e18293 (2011).
- Kouskoff, V., Lacaud, G., Schwantz, S., Fehling, H. J., Keller, G. Sequential development of hematopoietic and cardiac mesoderm during embryonic stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (37), 13170-13175 (2005).
- Xu, X. Q., et al. Chemically defined medium supporting cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Differentiation: Research in Biological Diversity. 76 (9), 958-970 (2008).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-1857 (2012).
- Bizy, A., et al. Myosin light chain 2-based selection of human iPSC-derived early ventricular cardiac myocytes. Stem Cell Research. 11 (3), 1335-1347 (2013).
