Osteoklasten Ableitung aus Knochenmark der Maus
Summary
Osteoklasten sind die Haupt knochenresorbierenden Zellen im Körper. Eine Fähigkeit, die Osteoklasten in großer Zahl zu isolieren hat erhebliche Fortschritte im Verständnis der Osteoklasten Biologie geführt. In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung, Kultivierung und Quantifizierung der Osteoklastenaktivität in vitro.
Abstract
Osteoklasten sind hoch spezialisierte Zellen, die von Monozyten / Makrophagen-Linie im Knochenmark abgeleitet sind. Ihrer einzigartigen Fähigkeit, sowohl die organischen und anorganischen Matrices von Knochen resorbieren, bedeutet, dass sie eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der Skelettumbau spielt. Gemeinsam sind Osteoblasten und Osteoklasten für die dynamische Kopplung Prozess, der sowohl die Knochenresorption und gemeinsam handeln, um den normalen Skelett während Gesundheit und Krankheit pflegen Knochenbildung beinhaltet verantwortlich.
Als Haupt knochenresorbierenden Zellen im Körper, können Änderungen in der Osteoklastendifferenzierung oder Funktion in tiefgreifende Wirkungen im Körper führen. Krankheiten mit veränderter Osteoklasten-Funktion verbunden sind, können im Schweregrad von letalen neonatalen Erkrankung aufgrund eines Fehlers einen Markraum für Hämatopoese bilden reichen, um mehr häufigsten beobachteten Pathologien wie Osteoporose, bei denen eine übermäßige Knochenresorption durch Osteoklasten prädisponiert Formation zu brechen.
ent "> Eine Fähigkeit, Osteoklasten in hoher Anzahl in vitro zu isolieren hat für bedeutende Fortschritte im Verständnis der Knochenumbauzyklus erlaubt und hat den Weg für die Entdeckung neuer therapeutischer Strategien, die Bekämpfung dieser Krankheiten geebnet.Hier beschreiben wir ein Protokoll zu isolieren und zu kultivieren Osteoklasten aus Knochenmark der Maus, die eine große Zahl von Osteoklasten ergeben wird.
Introduction
Knochenumbau ist dynamisch und umfasst die Kopplung von Knochenbildung mit Knochenresorption 1. Diese stark regulierten Prozess ist für die Aufrechterhaltung der Skelett während normaler Homöostase verantwortlich ist und in Reaktion auf eine Verletzung und Krankheit.
Osteoklasten sind einzigartig, mehrkernige Zellen, die fähig resorbierenden sowohl die organischen und anorganischen Matrizen von Knochen sind. Osteoklasten sind aus der Monozyten / Makrophagen-Linie im Knochenmark 2-5 abgeleitet. Anomalien in der Funktion oder Bildung von Osteoklasten in einer Vielzahl von klinischen Erkrankungen, einschließlich gemeinsamer Erkrankungen wie Osteoporose führen.
Die Fähigkeit, die Osteoklasten in vitro zu erzeugen hat signifikante Fortschritte im Verständnis von Knochen biology 6 erlaubt. Als Ergebnis werden neue therapeutische Mittel Schwellen Osteoklasten bedingten Krankheiten, die zur schweren Erkrankungen und Todesfälle verantwortlich sind, zu behandeln 7 </sup>. Homöostatische Wartung der Knochenmasse und Kraft erfordert die konzertierte Aktion der knochenbildenden Osteoblasten und Knochen Osteoklasten 8,9. Knochenhomöostase ist in einer Reihe von Krankheiten, einschließlich postmenopausalen Osteoporose verändert, bei denen erhöhte Osteoklastenaktivität führt zu pathogenen Verlust von Knochenmasse und Dichte 10. Mit zunehmender Verfügbarkeit von transgenen Mausmodellen menschlicher Krankheiten gibt es mehr Möglichkeiten, um die Rolle der Osteoklasten in menschlichen Knochenerkrankung 11-13 entziffern.
Zahlreiche Protokolle für Osteoklastenkulturverfahren werden in der Literatur, mit vielen Variationen beschriebene 9,12,14. Xing und Kollegen beschreiben ähnliche Methodik auf die nachstehend beschriebenen, in ihrer Beschreibung osteoclastogenic Assays von murinen Knochenmarkszellen Protokoll. Allerdings, um die Knochenmarkzellen nach langen Knochen Ernte freizugeben, Xing et al. Spülen Markhöhle mit α-MEM komplette Medien14. Catalfamo untersucht die Wirkung von Hyperglykämie auf die Osteoklastenfunktion und beschreibt ein Verfahren, bei denen alle Zellen von Knochenmark mobilisiert Spülung kultiviert für 24 Stunden, wobei an diesem Punkt die nicht-adhärenten Zellen werden verworfen, 12, auch eine Technik von Boyle et al . 9 Die zuvor veröffentlichten Protokollen erfordern die Durchführung der Spülung des Knochenmarks, eine mühsame Praxis, die führt auch das Risiko einer Nadelstichverletzung und den Verlust wertvoller Knochenmark, so muß man die beiden Enden des Knochens schneiden. Das Protokoll, das wir beschreiben, führt die Verwendung von Mörser und Pistill zu Osteoklasten zu isolieren, die ähnlich dem Verfahren von Weischenfeldt et al Makrophagen Isolation 15.
Unsere Erfahrung ist jedoch, dass Osteoklasten Isolierung und in vitro-Kultur unter Verwendung von früher veröffentlichten Verfahren ergibt unterschiedliche Ergebnisse in Bezug auf die Osteoklasten-Produktion, was häufigin der Unfähigkeit, die Osteoklasten zu kultivieren. Daher haben wir ein Protokoll, das für die konsequente Trennung von Knochenmark der Maus eine große Anzahl von mehrkernigen Osteoklasten in vitro, mit einer ungefähren Ausbeute von 70-80% der Zellen anfänglich plattierten Form Makrophagen und Osteoklasten erzeugen kann anschließend in Gegenwart entwickelt, Osteoklasten Induktionsmedien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine Fähigkeit, leicht zu isolieren und zu kultivieren eine große Zahl von Osteoklasten in vitro wurde für die Hilfe, Verständnis für Knochenbiologie und Osteoklasten-vermittelten Krankheiten voranzutreiben verantwortlich. Es war die Identifizierung von RANKL, die zu diesem führen, als es vor kurzem als Hauptregulator der Osteoklastenbildung, Differenzierung und das Überleben von 16 bis 18 identifiziert.
Es ist unsere Erfahrung, dass die in vitro-Kultivierung</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir erkennen die Unterstützung der NIH Zuschüsse R01 DE021683, R01 DE019434, U01 HL099776, The Oak Foundation und das Hagey Labor für Pädiatrische Regenerative Medizin.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200-038 | |
| M-CSF, recombinant mouse | Gibco | PMC2044 | |
| Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed) | R&D Systems | 462-TEC-010 | |
| Prostaglandin E2 | Sigma-Aldrich | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 |
References
- Sims, N. A., Martin, T. J. Coupling the activities of bone formation and resorption: a multitude of signals within the basic multicellular unit. BoneKEy reports. 3, 481 (2014).
- Kahn, A. J., Simmons, D. J. Investigation of cell lineage in bone using a chimaera of chick and quial embryonic tissue. Nature. 258, 325-327 (1975).
- Walker, D. G. Bone resorption restored in osteopetrotic mice by transplants of normal bone marrow and spleen cells. Science. 190, 784-785 (1975).
- Burger, E. H., et al. In vitro formation of osteoclasts from long-term cultures of bone marrow mononuclear phagocytes. The Journal of experimental medicine. 156, 1604-1614 (1982).
- Underwood, J. C. From where comes the osteoclast. The Journal of pathology. 144, 225-226 (1984).
- Lacey, D. L., et al. Bench to bedside: elucidation of the OPG-RANK-RANKL pathway and the development of denosumab. Nature reviews. Drug discovery. 11, 401-419 (2012).
- Brown, J. E., Coleman, R. E. Denosumab in patients with cancer-a surgical strike against the osteoclast. Nature reviews. Clinical oncology. 9, 110-118 (2012).
- Khosla, S. Minireview: the OPG/RANKL/RANK system. Endocrinology. 142, 5050-5055 (2001).
- Boyle, D. L., et al. Differential roles of MAPK kinases MKK3 and MKK6 in osteoclastogenesis and bone loss. PloS one. 9, (2014).
- Hofbauer, L. C., Heufelder, A. E. Role of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand and osteoprotegerin in bone cell biology. Journal of molecular medicine (Berlin, Germany). 79, 243-253 (2001).
- Teramachi, J., et al. Increased IL-6 Expression in Osteoclasts is Necessary but not Sufficient for the Development of Paget’s Disease of Bone. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. , (2013).
- Catalfamo, D. L., et al. Hyperglycemia induced and intrinsic alterations in type 2 diabetes-derived osteoclast function. Oral diseases. 19, 303-312 (2013).
- Schueler, J., et al. Intratibial injection of human multiple myeloma cells in NOD/SCID IL-2Rgamma(null) mice mimics human myeloma and serves as a valuable tool for the development of anticancer strategies. PloS one. 8, (2013).
- Xing, L., Boyce, B. F. RANKL-Based Osteoclastogenic Assays from Murine Bone Marrow Cells. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1130, 307-313 (2014).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH protocols. , (2008).
- Yamamoto, Y., et al. Osteoblasts provide a suitable microenvironment for the action of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand. Endocrinology. 147, 3366-3374 (2006).
- Yasuda, H., et al. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3597-3602 (1998).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, 165-176 (1998).
- Teitelbaum, S. L., Ross, F. P. Genetic regulation of osteoclast development and function. Nature reviews. Genetics. 4, 638-649 (2003).
- Agas, D., Sabbieti, M. G., Marchetti, L. Endocrine disruptors and bone metabolism. Archives of toxicology. 87, 735-751 (2013).
- Manolagas, S. C., O’Brien, C. A., Almeida, M. The role of estrogen and androgen receptors in bone health and disease. Nature Reviews Endocrinology. 9, 699-712 (2013).
- Martin, T. J., Udagawa, N. Hormonal regulation of osteoclast function. Trends in endocrinology and metabolism. 9, 6-12 (1998).
- Nakamura, T., et al. Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts. Cell. 130, 811-823 (2007).
- Bellido, T., et al. Regulation of interleukin-6, osteoclastogenesis, and bone mass by androgens. The role of the androgen receptor. The Journal of clinical investigation. 95, 2886-2895 (1995).
- Roato, I. Interaction among cells of bone, immune system, and solid tumors leads to bone metastases. Clinica., & developmental immunology. 2013, (2013).
- Autio, K. A., Morris, M. J. Targeting bone physiology for the treatment of metastatic prostate cancer. Clinical advances in hematolog., & oncology. 11, 134-143 (2013).
- Sottnik, J. L., Keller, E. T. Understanding and targeting osteoclastic activity in prostate cancer bone metastases. Current molecular medicine. 13, 626-639 (2013).
