Synthese van Immunotargeted Magneto-plasmonische Nanoclusters

Summary

Hier beschrijven we een protocol voor de synthese van magneto-plasmon nanodeeltjes met een sterk magnetisch moment en een sterke nabij-infrarood (NIR) absorptie. Het protocol omvat ook antilichaam conjugatie aan de nanodeeltjes door de Fc eenheid voor diverse biomedische toepassingen die moleculaire specifieke targeting vereisen.

Abstract

Magnetische en plasmonische eigenschappen gecombineerd in een enkel nanodeeltje zorgen voor een synergie die voordelig is in een aantal biomedische toepassingen zoals contrast verbetering in de roman magnetomotorische beeldvormende modaliteiten, tegelijkertijd nemen en detectie van circulerende tumorcellen (CTC's), en multimodale moleculaire beeldvorming gecombineerd met fotothermische therapie van kankercellen. Deze toepassingen hebben aanzienlijke belangstelling voor de ontwikkeling van protocollen voor synthese van magneto-plasmon nanodeeltjes met optische absorptie in het nabije infrarood (NIR) gebied en een sterk magnetisch moment gestimuleerd. Hier presenteren we een nieuw protocol voor de synthese van dergelijke hybride nanodeeltjes die is gebaseerd op een olie-in-water micro-emulsie methode. De unieke eigenschap van de hierin beschreven protocol synthese van magneto-plasmon nanodeeltjes van verschillende maten van primaire blokken die ook magneto-plasmon kenmerken. Deze benadering levert nanodeeltjes met een hoge densiteit van magnetische en plasmonische functionaliteiten die gelijkmatig zijn verdeeld over de nanodeeltjes volume. De hybride nanodeeltjes kunnen gemakkelijk worden gefunctionaliseerd door het aanbrengen van antilichamen door de Fc eenheid verlaat het Fab-deel dat verantwoordelijk is voor antigeenbinding voor targeting.

Introduction

Hybride nanodeeltjes bestaande uit verschillende materialen met verschillende fysisch-chemische eigenschappen kunnen nieuwe mogelijkheden openen in biomedische toepassingen, waaronder multimodale moleculaire beeldvorming, therapie levering en bewaking, nieuwe screening en diagnostische testen ^1-3. De combinatie van plasmon en magnetische eigenschappen in een nanodeeltje is van bijzonder belang omdat het een zeer sterk licht verstrooiing en absorptie doorsneden verbonden plasmonresonanties en kunnen reageren op een magnetisch veld. Zo werden magneto-plasmon nanodeeltjes gebruikt om contrast in donkere-field imaging van gemerkte cellen verhogen door een tijdelijke signaal modulatie via een externe elektromagneet ^3-5. Meer recent werd een soortgelijke grondslag voor de ontwikkeling van een nieuwe beeldvormende modaliteit - magneto-fotoakoestische imaging, waar magneto-plasmon nanodeeltjes mogelijk grote verbeteringen in contrast en signaal-achtergrond ratio ^6,7. Ook werd aangetoond dat de hybride nanodeeltjes kunnen worden gebruikt voor gelijktijdige opname en detectie van circulerende tumorcellen in bloed en in vivo ^8,9. Bovendien worden magneto-plasmon nanodeeltjes veelbelovende theranostische middelen die kunnen worden gebruikt voor moleculaire specifieke optische en MRI gecombineerd met fotothermische behandeling van kankercellen ^10.

Verschillende benaderingen werden verkend voor de synthese van magneto-plasmonische nanodeeltjes. Bijvoorbeeld, Yu et al. Gebruikt afbraak en oxidatie van Fe (CO) ₅ op gouden nanodeeltjes dumbbell-achtige bifunctionele Au-Fe ₃ O ₄ nanodeeltjes ¹¹ vormen. Wang et al. Hebben goud gecoate ijzeroxide nanodeeltjes gesynthetiseerd door het gebruik van thermische ontleding methode ^12. Enkele andere benaderingen afhankelijk coating polymeer of aminofunctionele moleculen aan magnetische kern nanodeeltjes gevolgd door afzetting van agoude shell op het polymeer oppervlak om de hybride te creëren deeltjes ^7,13. Bovendien werden ijzeroxide nanodeeltjes goud nanorods via elektrostatische interacties of een chemische reactie ^14,15 bevestigd. Hoewel deze benaderingen leveren magneto-nanostructuren, ze compromis enigszins eigenschappen van de magneto-plasmonische combinatie zoals optische absorptie in het nabije infrarood venster (NIR) of een sterk magnetisch moment beide zijn zeer wenselijk in biomedische toepassingen. Bijvoorbeeld, dumbbell Au-Fe ₃ O ₄ nanodeeltjes een plasmon resonantie piek bij 520 nm die hun bruikbaarheid in vivo beperkt door de hoge weefsel troebelheid in dit spectrale gebied. Bovendien is de magneto-plasmonische nanodeeltjes door huidige protocollen zijn beperkt tot slechts een ¹¹ of weinig (minder dan 10) ^14,15 superparamagnetische delen (bijvoorbeeld ijzeroxide nanodeeltjes) die significant minder dan had ach zijnieved in een dicht opeengepakte nanostructuur. Bijvoorbeeld, kan een dicht op elkaar gepakte 60 nm diameter bolvormige nanodeeltjes bevatten, in de orde van duizend van 6 nm superparamagnetische nanodeeltjes. Daarom is er een grote ruimte voor verbetering van magnetische eigenschappen van de hybride nanodeeltjes. Bovendien zijn sommige van de eerder beschreven protocollen zijn relatief complex en vereisen zorgvuldige optimalisatie om deeltjesaggregatie tijdens de synthese ^14,15 vermijden.

Hier beschrijven we een protocol voor de synthese van magneto-plasmonische nanodeeltjes met een sterk magnetisch moment en een sterke NIR-absorptie die belangrijke beperkingen van het huidige kunst-adressen. De synthese heeft zijn oorsprong in de olie-in-water micro-emulsie-methode ^16. Het is gebaseerd op de montage van nanodeeltjes van een gewenste grootte van een veel kleinere primaire deeltjes. Deze aanpak is met succes gebruikt om nanostructuren uit een enkel materiaal zoals goud, ijzeroxide en semiconductor pri producerenmary deeltjes ^16. We uitgebreid tot de synthese van magneto-plasmon nanodeeltjes door, eerst, waardoor 6 nm goud diameter shell / ijzeroxide kerndeeltjes en daarna samenstellen van de primaire hybride deeltjes in de uiteindelijke bolvormige nanostructuur. Montage primaire deeltjes in nanoclusters het niet alleen mogelijk verbeteren van de eigenschappen van de samenstellende nanodeeltjes, zoals het bereiken van een sterker magnetisch schip behoud superparamagnetische eigenschappen, maar maakt ook gebruik van de interacties tussen individuele nanodeeltjes zodoende nieuwe kenmerken afwezig de samenstellende nanodeeltjes, zoals sterke optische absorptie in het NIR venster. Dit protocol geeft hybride nanodeeltjes met een hoge magnetische en plasmon functionaliteiten. Na primaire deeltjes worden gesynthetiseerd, onze methode is in wezen een eenvoudige éénpotsreactie. De totale plasmon resonantie sterkte en magnetisch moment worden bepaald door een aantal primaire deeltjes en theroordat, kan eenvoudig worden geoptimaliseerd, afhankelijk van de aanvraag. Verder hebben we ook een procedure ontwikkeld voor het antilichaam conjugatie tot een hybride nanopartikels voor verschillende biomedische toepassingen die moleculaire specifieke targeting vereisen. Antilichamen worden door de Fc eenheid verlaat het Fab-deel dat verantwoordelijk is voor antigeenbinding voor targeting gehecht.

Protocol

1 instrumentatie en Glaswerk Voorbereiding

1. Geschikte kleding te dragen, dat wil zeggen, een laboratoriumjas, wegwerphandschoenen en oogbescherming.
2. Sluit een rondbodemkolf met een koeler en dompelen in een silicone oliebad met een temperatuur controle van een thermometer. Plaats een warmtebron (bijvoorbeeld kookplaat) onder oliebad (figuur 1). Gebruik een thermometer voor het meten van de temperatuur boven 260 ° C.

2 Synthese van Primary Hybrid Magneto-plasmonische Nanodeeltjes

1. Het maken van Magnetic Core Nanodeeltjes
   1. Voeg 353,2 mg (1 mmol) ijzer (III) acetylacetonaat, 1 ml (2 mmol) oliezuur, 1 ml (2 mmol) oleylamine, 1,292 g (5 mmol) 1,2-hexadecaandiol, en 10 ml fenyl ether op een vierkante -Bottom kolf.
   2. Roer het mengsel krachtig met een magnetische roerstaaf en verhit tot 250-260 ° C gedurende 1 uur onder reflux. Vervolgens wacht de oplossing afkoelentot RT. Controleer de temperatuur onder 260 ° C tot kookpunt van het fenyl ether voorkomen en verhinderen een uitbarsting van het reactiemengsel uit de kolf naar de condensor.
      LET OP: Het reactiemengsel is zeer heet en de chemicaliën kunnen irritatie veroorzaken. Moeten opereren onder een zuurkast en draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. Zorg voor voldoende ventilatie van het oliebad.
      OPMERKING: De oliebad gehouden bij 250-260 ° C gedurende 1 uur tijdens de synthese van de magnetische nanodeeltjes. In principe kan een Pyrex glazen schaal worden gebruikt voor dit doel. Echter, de maximale continue temperatuur van Pyrex glas is ~ 260 º C volgens de informatie die de leverancier. Daarom is een metalen houder verschaft een veiligere optie voor de reactie aangezien het een hogere temperatuur kan weerstaan ​​en langer in meerdere runs.
2. Depositie een gouden schelp op magnetische kern nanodeeltjes
   1. Voeg 411,5 mg (1,1 mmol) goud acetate, 0,25 ml (0,75 mmol) oliezuur, 1,5 ml (3,0 mmol) oleylamine, 775,3 mg (3 mmol) 1,2-hexadecaandiol, en 15 ml fenyl ether een rondbodemkolf.
   2. Voeg 5 ml suspensie van magnetische nanodeeltjes uit stap 2.1. Verwarm het reactiemengsel tot 180 ° C en houdt onder terugvloeikoeling gedurende 1 uur. Wacht tot de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur.
   3. Voeg 50 ml ethanol aan de hybride primaire nanodeeltjes gevolgd door centrifugatie precipiteren bij 3250 xg gedurende 15 minuten.
   4. Resuspendeer het neerslag in 25 ml hexaan met een badsonificeerinrichting. Voeg 25 ml ethanol aan de primaire hybride nanodeeltjes te precipiteren. Centrifugeer bij 3250 xg gedurende 15 min en resuspendeer de neerslag in hexaan. Herhaal deze stap drie keer.
   5. Droog de neergeslagen primaire hybride nanodeeltjes in een vacuümexsiccator O / N. Bevestigen dat de deeltjes helemaal droog zijn.

3 Hybrid Magneto-plasmonische Nanoclusters Synthese en Maat Scheiding

1. Voeg de oplossing uit stap 3,1-10 ml waterige oplossing van natriumdodecylsulfaat (2,8 mg / ml) in een 20 ml glazen flesje met aangehechte caps. Voeg de suspensie primaire hybride nanopartikels druppelsgewijs vermijden vermenging van de twee fasen voor de volgende stap.
2. Ultrasone trillingen de tweefasige oplossing in een badsonicator gedurende 2 uur, gevolgd door verwarmen in een waterbad bij 80 ° C gedurende 10 minuten. Wacht tot de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur.
   1. Vul het water aan het operationele niveau lijn van de geluidsgolven bad. Centreer de glazen flacon in de ultrasoonapparaat bad. Een emulsie vormt zich onmiddellijk tussen de twee fasen. Schud de tweefasige oplossing handmatig na aanvang van de sonicatie; Dit vergemakkelijkt het mengen tussen de fase die primaire hybride nanopartikels en de onderste waterige fase.
      LET OP: Wees je bewust that de sonicator warmt na 2 uur van de exploitatie.
3. Centrifugeer de hybride nanocluster suspensie bij 100 xg gedurende 30 minuten. Verzamel zowel de neerslag en de supernatant. Resuspendeer de neerslag in 0,1 mM natriumcitraat onder de 10 min geluidsgolven. De verwachte grootte van de nanoclusters is ~ 180 nm in diameter.
4. Breng de bovenstaande vanaf stap 3.3 naar een nieuwe conische buis.
5. Centrifugeer de suspensie van stap 3.4 bij 400 xg gedurende 30 minuten. Verzamel zowel de neerslag en de supernatant. Resuspendeer de neerslag in 0,1 mM natriumcitraat onder de 10 min geluidsgolven. De verwachte grootte van de nanoclusters is ~ 130 nm in diameter.
6. Breng de supernatant van stap 3.5 een nieuwe conische buis.
7. Centrifugeer de suspensie van stap 3.6 bij 1500 xg gedurende 30 minuten. Verzamel het neerslag en resuspendeer in 0,1 mM natriumcitraat onder de 10 min geluidsgolven. De verwachte grootte van de nanoclusters is ~ 90 nm in diameter.
8. Voeg 300 _6, l nanocluster suspensie een 96-wells microplate reader voor het meten van een UV-Vis-NIR-absorptiespectrum. Drop 10 ul nanocluster schorsing op koolstof beklede koperen rooster voor TEM-beeldvorming.

4 Conjugatie van monoklonale antilichamen Nanoclusters

1. Bereid 100 pl monoklonaal antilichaam (1 mg / ml) in PBS, pH 7,2, bijvoorbeeld anti-Epidermale Groei Factor Receptor 2 (HER2)-antilichamen of anti-Epidermale Groei Factor Receptor 1 (EGFR) antilichamen.
2. Voeg de antilichaamoplossing van stap 4,1-3,9 ml 4 mM HEPES, pH 7,2. Centrifugeer de oplossing door een 10 k MWCO centrifugale filter bij 3250 xg gedurende 20 minuten bij 8 ° C. Resuspendeer het antilichaam in 4 mM HEPES, pH 7,2, tot een eindvolume van 100 pl.
   Opmerking: Deze stap wordt uitgevoerd om het oorspronkelijke medium vervangen het antilichaam oplossing HEPES.
3. Voeg 10 ul van 100 mM NalO _4-100 ui antilichaamoplossing. Bedek de reactie flacon met een aluminum folie op kamertemperatuur en meng gedurende 30 minuten met behulp van een schudapparaat.
4. Schrik de reactie af door toevoeging van 500 pi 1X PBS.
5. Voeg 2 pl 46,5 mM linker oplossing (dithiolaromatic PEG6-CONHNH ₂₎ aan het antilichaam oplossing uit stap 4.4 en schud gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
6. Filtreer de oplossing met behulp van een 10 k MWCO centrifuge filter bij 3250 xg gedurende 20 minuten bij 8 ° C. Resuspendeer het antilichaam in 1x PBS tot een eindvolume van 100 ul wat leidt tot een antilichaamconcentratie van ~ 1 mg / ml.
7. Meng 100 ui nanocluster suspensie OD ~ 1,0 met 1 pi gemodificeerde antilichamen van stap 4.6 (1 mg / ml) gedurende 120 min bij kamertemperatuur.
8. Voeg 10 ul van 10 ^-3 M 5 kDa PEG thiol en schud gedurende 15 min bij KT.
9. Centrifugeer de oplossing bij 830 x g gedurende 3 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de sediment in 100 ui 2% w / v 5 kDa PEG in PBS, pH 7,2.
10. Meet de absorptie spectrum van het antilichaam-geconjugeerde nanoclusters en vergelijk tot thij absorptie spectrum van de kale nanoclusters. Verwacht een paar nanometer rood verschuiving na de vervoeging.
11. Als de nanodeeltjes aggregeren zoals blijkt uit een significante verschuiving met een toename van OD regio rood-NIR, verhoging van de concentratie van PEG thiol tot 5 x 10 ^-3 M. Ook vergroten de incubatietijd met thiol PEG 30 min en de centrifugale snelheid in stappen 200 xg verlagen.
12. Voor kankercel labeling test, voeg het antilichaam geconjugeerd nanodeeltjes van stap 4.9 kankercel suspensie in ofwel medium of 1x PBS (1 ml ~ 10 ⁶ cellen) en meng gedurende 60 minuten.

Representative Results

Een schema voor de synthese van immunotargeted magneto-plasmon nanoclusters wordt getoond in figuur 2. Eerst worden magnetische Fe ₃ O ₄ ijzeroxide nanodeeltjes gesynthetiseerd door thermische ontleding methode. Vervolgens wordt een dunne ca. 1 nm goud shell afgezet op ijzeroxide kerndeeltjes via thermische ontleding. De primaire ca. 6 nm hybride nanopartikels dienen als zaden magneto-plasmon nanoclusters maken door gebruik van een olie-in-water micro-emulsie benadering. De nanoclusters worden gefunctionaliseerde met monoklonale antilichamen voor moleculaire specifieke targeting.

De grootte van gesynthetiseerde ijzeroxide kern nanodeeltjes ~ 5 nm in diameter. Na goud shell neerslaan op de magnetische kern, de grootte van de primaire ijzeroxide kern / schaal nanodeeltjes goud toe tot ~ 6 nm in diameter. De colloïdale kleur verandert van bruin voor ijzeroxide nanodeeltjes tot rood-paarse na afzetting van de gouden schaal en,tenslotte tot paars-grijze kleur na montage van de primaire deeltjes in ~ 180 nm diameter bolvormig nanoclusters (figuur 3). UV-Vis spectra blijkt dat primaire ijzeroxide kern / schil goud nanodeeltjes hebben een kenmerkende resonantie piek bij 530 nm die niet in kale ijzeroxidedeeltjes (figuur 4). Bij clustervorming, het spectrum verandert sterk en vertoont een sterke brede NIR absorptie (figuur 4).

De nanoclusters geconjugeerd met monoklonale antilichamen specifiek te richten biomoleculen plaats. De conjugatie protocol gebruikt een heterofunctionele polyethyleenglycol (PEG) linker die Fc-gebied van antilichamen hecht aan het oppervlak nanocluster. Een uiteinde van de linker een hydrazide groep die samenwerkt met geoxideerde geglycosyleerd antüichaamgroep. Het andere uiteinde van de linker bevat een di-thiol groep die een sterke affiniteit voor het goudoppervlak van de nanoclusters heeft. Te laten zien ve moleculaire targeting we een EGFR positieve huidkanker cellijn (A-431) en HER2 positieve borstkanker cellijn (SK-BR-3) gekozen. Nanoclusters werden gefunctionaliseerd met ofwel anti-EGFR of anti-HER2-antilichamen, gevolgd door mengen met A-431 en SK-BR-3 kanker cellen. In figuur 5, een heldere goud-oranje kleur op A-431 en SK-BR-3 kankercellen aangegeven moleculaire specifieke binding van nanoclusters overeenkomstige receptoren op kankercellen. Daarentegen vertoonde ongerichte gePEGyleerd nanoclusters geen interactie met kankercellen. Deze resultaten tonen moleculaire specificiteit van de gefunctionaliseerde nanoclusters.

Figuur 1 Een experimentele opzet voor de synthese van primaire ijzeroxide kern / schil goud nanodeeltjes. Een rondbodemkolf is verbonden met een koeler. Het reactiemengsel wordt uitgevoerd in een oliebad onder temperatuurcontrole gedragen door een thermometer.

Figuur 2 Schematische illustratie van belangrijke stappen in de synthese van immunotargeted magneto-plasmonische nanoclusters. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3 TEM beelden en kleur van colloïdale suspensies van nanodeeltjes: (Links) ijzeroxide nanodeeltjes kern; (Midden) goud gecoate ijzeroxide nanodeeltjes; (Rechts) hybride magneto-plasmonische nanoclusters. Schaal bar voor TEM-beelden is 50 nm. ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/52090/52090fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4 (A) UV-Vis-NIR spectra van ijzeroxide nanodeeltjes kern (blauw), goud gecoate ijzeroxide nanodeeltjes (groen), en hybride magneto-plasmonische nanoclusters (rood). (B) UV-Vis-NIR spectra van hybride magneto-plasmonische nanoclusters met verschillende maten: 90 nm (blauw), 130 nm (groen) en 180 nm (rood). Alle spectra zijn genormaliseerd om een op de maximale absorptie van verschillen in spectrale profielen te tonen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. ank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5 Moleculaire specificiteit van het antilichaam geconjugeerd magneto-plasmonische nanoclusters: (Links) EGFR-expressie A-431 huidkanker cellen geïncubeerd met EGFR gerichte nanoclusters; (Midden) HER2 uitdrukken SK-BR-3 borstkankercellen geïncubeerd met HER2-gerichte nanoclusters; (Rechts) A-431 cellen geïncubeerd met ongerichte PEGylated nanoclusters. De geel-oranje kleur van de cellen geeft een succesvolle etikettering door de gefunctionaliseerde nanoclusters; grijs-blauwachtige kleur overeenkomt met een endogene verstrooiing van cellen. De beelden werden verkregen met behulp van rechtopstaande microscoop met objectief 20X donker-veld en Xe lamp excitatie. Schaal bar is 10 micrometer._blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Film 1. Deze video vergelijkt een reactie van A-431 kankercellen gekenmerkt door een primaire nanodeeltjes of nanoclusters een extern magnetisch veld. Beide types deeltje wanneer geconjugeerd met anti-EGFR-antilichamen voor specifieke targeting van de EGFR (+) A431 cellen. Eerst werd een Eppendorf buis gevuld met een suspensie van gemerkte cellen. Vervolgens werd een magneet geplaatst naast de buis en de beweging van cellen werd afgebeeld op ca. 10 mm van de magneet. De film op de linkerkant toont cellen gelabeld met primaire nanodeeltjes (6 nm in diameter) en de film op de juiste - cellen gelabeld met magneto-plasmonische nanoclusters (100 nm in diameter). De films werden verkregen met behulp van een omgekeerde microscoop in bright-field-modus met een 20X objectief. Schaalbalk is 100 urn.

Discussion

Kritische stappen in de geslaagde synthese van magneto-plasmonische nanoclusters omvatten het maken van zeer monogedispergeerde primaire goud shell / ijzeroxide nanodeeltjes kern en regisseren zelf-assemblage van de primaire deeltjes in nanoclusters. Een molaire verhouding tussen de primaire deeltjes en oppervlakteactieve stoffen spelen een belangrijke rol bij het bepalen van grootteverdeling van de nanoclusters. Niet-uniforme grootte verdeling van de primaire nanodeeltjes kan de vorming van grote aggregaten veroorzaken tijdens de montage van de magneto-plasmonische nanoclusters. Bovendien, de micro-emulsie werkwijze nanocluster vorming voert amfifiele oppervlakteactieve hydrofobe staart groepen komen primaire nanodeeltjes elkaar en hydrofiele kopgroepen stabiliseren nanoclusters in een waterige oplossing. Concentratie van oppervlakteactieve bepaalt nanocluster samenstel: een hoge concentratie zou leiden tot de vorming van kleinere nanoclusters of afzonderlijke primaire deeltjes en een lage concentratie zou leiden tot deeltjesaggregatie.

ca. 50 nm tot ca. 300 nm, dat een extra scheiding stap vereist. Centrifugeren met een geleidelijk toenemende snelheid zoals beschreven in het protocol boven goede resultaten met gescheiden fracties met grootteverdelingen 90 ± 18 nm, 130 ± 26 nm en 180 ± 39 nm. Fijnere scheiding aan smallere distributies te produceren moet het mogelijk zijn met behulp van een grootte-uitsluiting chromatografie. Ook moet worden opgemerkt dat de nanoclusters een brede absorptie in het rode NIR-gebied die de gelegenheid plasmonresonanties prikkelen met alle bronnen tussen ca. 500 en 900 nm (figuur 4) is bepaald. Echter, deze eigenschap beperkt ook de toepasbaarheid van de nanoclusters in simultane beeldvorming van meerdere doelen.

Een hydrodynamische straal van nanoclusters stijgt met ~ 10-15 nm na antilichaam conjugatie. Deze toename van de diameter correleert WELl met ca. 12 nm grootte van een IgG-antilichaam dat is aangesloten via de Fc eenheid aan het oppervlak van nanodeeltjes. De wijziging in het hydrodynamische diameter overeenstemt met de directionele conjugatiechemie van antilichamen door het Fe deel dat het protocol toegepast. Zeta potentieel van nanodeeltjes verschuift van -47,6 mV voordat antilichaam conjugatie tot -7,0 mV na de vervoeging. De verandering van de oppervlaktelading verschaft aanvullend bewijs antilichaam conjugatie aan nanoclusters.

De unieke eigenschap van de hierin beschreven protocol synthese van magneto-plasmon nanodeeltjes van verschillende maten van primaire blokken die ook magneto-plasmon kenmerken. Deze werkwijze is een eenvoudige manier om tegelijk bedienen de sterkte van plasmonische en magnetische eigenschappen van het verkregen nanostructuren. Daarentegen eerdere protocollen gebruikt een samenstel van plasmon en magnetische nanomateriaals waar een materiaal diende als een matrijs voor afzetting van de andere; in deze benadering een materiaal inneemt volume en het andere oppervlak van de resulterende nanostructuren. Magneto-plasmon nanodeeltjes in de literatuur significant lagere dichtheid en de totale hoeveelheid superparamagnetische deeltjes vergeleken met de nanoclusters door ons protocol ^14,15. In onze methode magnetische en plasmon resten gelijkmatig in het volume van hybride magneto-plasmon nanodeeltjes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PYREX 50 ml round bottom boiling flask with short neck & 24/40 [ST] joint	Corning	4320A-50	Thermal decomposition reaction
PYREX 41 x 300 mm 5-bulb Allihn condenser with 24/40 [ST] outer/inner joints	Corning	2480-300	Thermal decomposition reaction
Silicone oil	Fisher	S159-500	Oil bath
Hot plate stirrer	Corning	PC-351	Heat the reacton with stirring function
Thermometer	ThermoWorks	221-092	Measure temperature
Iron(III) acetylacetonate	Fisher	AC11913-0250	Material for primary hybrid nanoparticles synthesis
Oleic acid 99%	Fisher	A195-500	Material for primary hybrid nanoparticles synthesis
Gold(III) acetate	Fisher	AA3974206	Material for primary hybrid nanoparticles synthesis
Hexane	Fisher	H292-1	Material for primary hybrid nanoparticles synthesis
Phenyl ether 99%	Fisher	AC13060-0025	Material for primary hybrid nanoparticles synthesis
1,2-Hexadecanediol 90%	Sigma	213748-50G	Material for primary hybrid nanoparticles synthesis
Oleylamine 70%	Sigma	O7805-100G	Material for primary hybrid nanoparticles synthesis
Sodium dodecyl sulfate	Fisher	BP166-100	Cluster synthesis
Sodium citrate dihydrate	Sigma	W302600	Cluster synthesis
Monoclonal anti-EGF receptor antibody	Sigma	E2156	Cell labeling specificity test
Monoclonal anti-HER2 antibody	Sigma	AMAB90627	Cell labeling specificity test
Sodium periodate	Sigma	311448	Oxidate Fc region of antibodies
Dithiolaromatic PEG6-CONHNH2	SensoPath Technologies	SPT-0014B	Heterofunctional linker for antibody conjugation to nanoclusters
Methoxy-PEG-thiol, 5 k	Creative PEGworks	PLS-604	Passivate the remaining gold surface after antibody conjugation
Amicon Ultra-4 centrifugal filter unit with Ultracel-10 membrane	Millipore	UFC801008	Protein purification
HEPES	Sigma	H3375	Buffer
PBS, 1x solution	Fisher	BP2438-20	Buffer
UV-Vis spectroscopy	BioTek	Synergy HT	Obtain spectrum
Centrifuge	Eppendorf	5810R	Separation
Transmission Electron Microscope	FEI	TECNAI G2 F20 X-TWIN	Obtain morphology of nanostructures
Upright microscope	Leica	DM6000	Obtain dark-field images
Sonicator	Branson	1510	Sonication
Carbon film 300 mesh grid	EMS	CF300-Cu	TEM imaging
96-well plate	Corning	09-761-145	UV-Vis reading plate