Fluorescens-basert overvåking av PAD4 aktivitet via en Pro-fluorescens substratanalog
Summary
PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.
Abstract
Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein substrates. The histone tails represent one of the most heavily modified stretches within all human proteins. Peptidyl-arginine deiminase 4 (PAD4) has been shown to convert arginine residues into the non-genetically encoded citrulline residue. Few assays described to date have been operationally facile with satisfactory sensitivity. Thus, the lack of adequate assays has likely contributed to the absence of potent non-covalent PAD4 inhibitors. Herein a novel fluorescence-based assay that allows for the monitoring of PAD4 activity is described. A pro-fluorescent substrate analog was designed to link PAD4 enzymatic activity to fluorescence liberation upon the addition of the protease trypsin. It was shown that the assay is compatible with high-throughput screening conditions and has a strong signal-to-noise ratio. Furthermore, the assay can also be performed with crude cell lysates containing over-expressed PAD4.
Introduction
Et stort antall pattedyrproteiner er sterkt modifisert ved innvirkning av enzymer som følge av biosyntesen av proteiner ved ribosomet. Disse posttranslasjonelle modifikasjoner (PTMs) kan øke den funksjonelle mangfoldet i proteomet ved å endre størrelse, kostnad, struktur og oligomerisering staten (blant andre funksjoner) av proteiner 1-3. Som et resultat, kan endringen i proteinstrukturen føre til fysiologiske konsekvenser, for eksempel proteindegradering, celledifferensiering, signalering, genekspresjon i modulering, og protein-protein interaksjoner. Mens disse modifikasjonene er utbredt i en stor andel av alle menneskelige proteiner, avslutter terminalen på histonproteiner gjennomgå et uvanlig høyt antall kovalente modifikasjoner 4. Histonproteinene er en familie av strukturelle proteiner som letter kondensasjonen av genomisk DNA. Kovalente modifikasjoner av de ustrukturerte histone haler er gjennomført og regulert av en series av enzymer som kan katalyserer kovalent modifisering av rester (forfattere), reversere de samme modifikasjoner (viskelær), og skille mellom de endringene som blir trykt på de histone haler (lesere) 5-7. Faktisk kan de fleste av de kjente PTMs holdes innenfor denne korte segment av histon inkludert metylering, fosforylering, acetylering, sumoylation, ubikineringsinhibitor, og citrullination 8.
Citrullination involverer omdannelse av peptidyl-arginin til det ikke- t-RNA som er kodet peptidyl-citrullin (figur 1A). De proteiner, som er ansvarlige for denne sidekjede nøytralisering, er medlemmer av puten (p eptide en rginine eiminase d) proteinfamilien, som alle er kalsium-avhengige enzymer. 9,10. Til dags dato har fem medlemmer av PAD familien blitt beskrevet (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4, og PAD6). Hvert medlem av denne familien ser ut til å målrette bestemte cellulære proteiner og også viser unique vev distribusjons profiler. PAD4 er det eneste medlemmet av dette protein familien er kjent for å være lokalisert i kjernen via et kjernelokaliseringssekvens 11. Følgelig har det vist seg å deiminate en rekke kjernefysiske mål, også arginin sidekjeder på de N-terminale haler av histoner H2A argininrest 3 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17, og H3R26) og H4 (H4R3) 12, 13. Mens hver av PAD isozymer har konkrete og kritiske fysiologiske funksjoner, har PAD4 fått betydelig mer oppmerksomhet på grunn av sin rolle i en rekke menneskelige prosesser i både syke og friske celler. Nylig, PAD4 viste seg å være et medlem av pluripotency transkripsjonell nettet 14. Begge PAD4 uttrykk nivåer og aktivitet ble vist å være forhøyet ved omprogrammering og bakkestats pluripotente stater i mus. Ved å kontrollere reguleringen av stamcelle gener, kan PAD4 beholde en sentral rolle i cellulær omprogrammering effektivitet. PAD4 har også vært innblandet idannelse av nøytrofile ekstracellulære feller, som ved binding av patogener aktivere deres system klaring. Den hypercitrullination av histon proteiner ved PAD4 induserer decondensation av kromatin, som tjener som basismateriale for innkapsling av patogene bakterier hos den ekstracellulære felle, således valgkrets av bakterielle infeksjoner 15,16.
I tillegg har PAD4 blitt funnet å spille en aktiv rolle i en rekke menneskelige sykdommer. Det er tidligere blitt vist at avvikende ekspresjon av PAD4 er forbundet med utbrudd og alvorlighetsgraden av reumatoid artritt, Alzheimers, Parkinsons sykdom, multippel sklerose og 17. Faktisk nærvær av anti-protein-antistoffer citrullinert er en av de mest pålitelige og definitive diagnostiske og prognostiske biomarkører av reumatoid artritt 18.. Likeledes har dysregulerte PAD4 aktivitet har nylig blitt observert i en rekke humane kreftformer, inkludert eggstokkreft, bryst, lunge, end esophageal kreft 19-22. Koblingen mellom PAD4 og kreft har blitt vist å være mediert gjennom ELK1 onkogen eller via p53 tumor suppressor protein 22,23 og tidligere arbeid har foreslått at PAD4 kan være en ny anti-cancer terapeutisk mål 17,24,25. Som et bevis på prinsippet studie ble uttømming av PAD4 via shRNA i tykktarmskreft cellelinje HCT116 avslørt å være tilstrekkelig for å indusere apoptose og cellesyklus arrest 26. En nylig utviklet irreversible PAD4 inhibitor førte til en sytti prosent reduksjon i tumormasse i mus 27. Ganske bemerkelsesverdig, dukket PAD4 hemming å fungere som en målrettet terapi som resulterte i selektiv avliving av kreftceller mens sparsom utransformerte celler.
Bruken av små molekyler for å slå av funksjonen til PAD4 kan vise seg å være en kraftig ny strategi for å målrette kreftceller eller å forsterke eksisterende kreft kjemoterapeutika 28. Dessverre, en potelt reversibel PAD4 inhibitor har ennå å bli oppdaget. Et antall kovalente inhibitorer har blitt utviklet ved hjelp av klor / fluor imidin håndtak som etterligner arginin substratet 27,29,30 og har vist seg å være praktiske verktøy for å forstå rollen til PAD4 i både friske og syke celler tilstand. Imidlertid er disse molekyler inhibere alle de aktive elektroder med lik potens. Derfor er det behov for en lettvint assay som rapporterer på aktiviteten av PAD4 avgjørende. Til dags dato har PAD4 analyser blitt beskrevet som knytter frigjøring av ammoniakk fra reaksjonen til en kolorimetrisk avlesning 31, benytte en fluorescensmerket chloroamidine substratanalog for fluorescens-polarisasjon assay 32, er avhengige av den syre-assistert reaksjon mellom glyoksal og citrullin 33, og par av PAD4 aktiviteten til et fluorescens dequenching trinn 34. Av disse er bare den kovalente modifier haloacetamidine strategien har vist seg å være kompatible med high-throughput skrEning plattformer 32,35,36. Vi beskriver en lettvinte fluorescens basert assay som på en pålitelig måte måler aktiviteten av PAD4. Analysen, som viser et sterkt signal-til-støy-forhold, hastighet for analyse, og robusthet for måling, har potensial til å oppdage en virkelig potent og selektiv inhibitor PAD4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Herein, a fluorescence based assay was successfully developed that monitors the activity of PAD4. The assay has proven to be incredibly robust in a number of high-throughput conditions and is also compatible with whole cell lysates37.
The affinity between the histone proteins and the DNA strands surrounding it loosens due the neutralization of the positive charge on the arginine side chain upon citrullination. It was envisioned that the neutralization of the arginine side-chain coul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Lehigh University Start-up Package. We thank Dr. Walter Fast for providing the GST-PAD4 plasmid for protein expression.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI) | Amresco | J106-2KG | http://www.amresco-inc.com |
| Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP902-25 | http://www.fishersci.com |
| Isopropylthiagalactonse (IPTG) | Life Technogolies | 15529-019 | http://www.lifetechnologies.com |
| All Buffer Salts | Fisher Scientific | N/A | Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc. |
| Protino Glutathione (GSH) agarose | Machery-Nagel | 745500.10 | Store at 4 °C; http://www.mn-net.com/ |
| Z-Arg-Arg-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride (Zcoum) | Sigma Aldrich | C5429 | www.sigmaaldrich.com |
| Chloroamidine | Cayman Chemical | 10599 | Store at -20 °C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP HCl) | Thermo Scientifc | 20490 | http://www.piercenet.com |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | www.sigmaaldrich.com |
| Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384) | N/A | N/A | Purchase from Corning; Sigma-Aldrich |
| Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software | N/A | N/A | www.tecan.com |
| Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter | N/A | N/A | http://www.perkinelmer.com |
References
- Jensen, O. N. Interpreting the protein language using proteomics. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 391-403 (2006).
- Sims, R. J., Reinberg, D. Is there a code embedded in proteins that is based on post-translational modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 815-820 (2008).
- Pandey, A., Mann, M. Proteomics to study genes and genomes. Nature. 405, 837-846 (2000).
- Berger, S. L. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. 447, 407-412 (2007).
- Fischle, W., Wang, Y., Allis, C. D. Binary switches and modification cassettes in histone biology and beyond. Nature. 425, 475-479 (2003).
- Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 1025-1040 (2007).
- Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 473-483 (2006).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403, 41-45 (2000).
- Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease. Bioessays. 25, 1106-1118 (2003).
- Gyorgy, B., Toth, E., Tarcsa, E., Falus, A., Buzas, E. I. Citrullination: a posttranslational modification in health and disease. Int. J. Biochem. Cell Biol. 38, 1662-1677 (2006).
- Nakashima, K., Hagiwara, T., Yamada, M. Nuclear localization of peptidylarginine deiminase V and histone deimination in granulocytes. J. Biol. Chem. 277, 49562-49568 (2002).
- Hagiwara, T., Hidaka, Y., Yamada, M. Deimination of histone H2A and H4 at arginine 3 in HL-60 granulocytes. Biochemistry. 44, 5827-5834 (2005).
- Kearney, P. L., et al. Kinetic characterization of protein arginine deiminase 4: a transcriptional corepressor implicated in the onset and progression of rheumatoid arthritis. Biochemistry. 44, 10570-10582 (2005).
- Christophorou, M. A., et al. Citrullination regulates pluripotency and histone H1 binding to chromatin. Nature. 507 (7490), 104-108 (2014).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. J. Exp. Med. 207, 1853-1862 (2010).
- Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J. Cell. Biol. 184, 205-213 (2009).
- Wang, S., Wang, Y. Peptidylarginine deiminases in citrullination, gene regulation, health and pathogenesis. Biochim. Biophys. Acta. 1829, 1126-1135 (2013).
- Trouw, L. A., Mahler, M. Closing the serological gap: promising novel biomarkers for the early diagnosis of rheumatoid arthritis. Autoimmun. Rev. 12, 318-322 (2012).
- Chang, X., Fang, K. PADI4 and tumourigenesis. Cancer Cell Int. 10, 7 (2010).
- Wang, L., Chang, X., Yuan, G., Zhao, Y., Wang, P. Expression of peptidylarginine deiminase type 4 in ovarian tumors. Int. J. Biol. Sci. 6, 454-464 (2010).
- Chang, X., et al. Investigating the pathogenic role of PADI4 in oesophageal cancer. Int. J. Biol. Sci. 7, 769-781 (2011).
- Zhang, X., et al. Genome-wide analysis reveals PADI4 cooperates with Elk-1 to activate c-Fos expression in breast cancer cells. PLoS Genet. 7, (2011).
- Tanikawa, C., et al. Regulation of histone modification and chromatin structure by the p53-PADI4 pathway. Nat. Commun. 3, 676 (2012).
- Cui, X., et al. The induction of microRNA-16 in colon cancer cells by protein arginine deiminase inhibition causes a p53-dependent cell cycle arrest. PLos One. 8, (2013).
- Jones, J. E., Causey, C. P., Knuckley, B., Slack-Noyes, J. L., Thompson, P. R. Protein arginine deiminase 4 (PAD4): Current understanding and future therapeutic potential. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12, 616-627 (2009).
- Li, P., et al. Regulation of p53 target gene expression by peptidylarginine deiminase 4. Mol. Cell Biol. 28, 4745-4758 (2008).
- Wang, Y., et al. Anticancer peptidylarginine deiminase (PAD) inhibitors regulate the autophagy flux and the mammalian target of rapamycin complex 1 activity. J. Biol. Chem. 287, 25941-25953 (2012).
- Slack, J. L., Causey, C. P., Thompson, P. R. Protein arginine deiminase 4: a target for an epigenetic cancer therapy. Cell. Mol. Life Sci. 68, 709-720 (2011).
- Luo, Y., Knuckley, B., Lee, Y. H., Stallcup, M. R., Thompson, P. R. A fluoroacetamidine-based inactivator of protein arginine deiminase 4: design, synthesis, and in vitro and in vivo evaluation. J. Am. Chem. Soc. 128, 1092-1093 (2006).
- Knuckley, B., et al. Substrate specificity and kinetic studies of PADs. Biochemistry. 1, 4852-4863 (2010).
- Knipp, M., Vasak, M. A colorimetric 96-well microtiter plate assay for the determination of enzymatically formed citrulline. Anal. Biochem. 286, 257-264 (2000).
- Knuckley, B., et al. A fluopol-ABPP HTS assay to identify PAD inhibitors. Chem. Commun. 46, 7175-7177 (2010).
- Bicker, K. L., Subramanian, V., Chumanevich, A. A., Hofseth, L. J., Thompson, P. R. Seeing citrulline: development of a phenylglyoxal-based probe to visualize protein citrullination. J. Am. Chem. Soc. 134, 17015-17018 (2012).
- Wang, Q., Priestman, M. A., Lawrence, D. S. Monitoring of protein arginine deiminase activity by using fluorescence quenching: multicolor visualization of citrullination. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 2323-2325 (2013).
- Jones, J. E., et al. Synthesis and screening of a haloacetamidine containing library to identify PAD4 selective inhibitors. ACS Chem. Biol. 7, 160-165 (2012).
- Dreyton, C. J., et al. . Optimization and characterization of a pan protein arginine deiminase (PAD) inhibitor. , (2010).
- Shimoyama, S., et al. Deimination stabilizes histone H2A/H2B dimers as revealed by electrospray ionization mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 45, 900-908 (2010).
- Luo, Y., et al. Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization. Biochemistry. 45, 11727-11736 (2006).
