Monitoreo basado en la fluorescencia de PAD4 actividad a través de un sustrato Analog Pro-fluorescencia
Summary
PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.
Abstract
Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein substrates. The histone tails represent one of the most heavily modified stretches within all human proteins. Peptidyl-arginine deiminase 4 (PAD4) has been shown to convert arginine residues into the non-genetically encoded citrulline residue. Few assays described to date have been operationally facile with satisfactory sensitivity. Thus, the lack of adequate assays has likely contributed to the absence of potent non-covalent PAD4 inhibitors. Herein a novel fluorescence-based assay that allows for the monitoring of PAD4 activity is described. A pro-fluorescent substrate analog was designed to link PAD4 enzymatic activity to fluorescence liberation upon the addition of the protease trypsin. It was shown that the assay is compatible with high-throughput screening conditions and has a strong signal-to-noise ratio. Furthermore, the assay can also be performed with crude cell lysates containing over-expressed PAD4.
Introduction
Un gran número de proteínas de mamíferos son muy modificada por la acción de enzimas después de la biosíntesis de proteínas por el ribosoma. Estas modificaciones post-traduccionales (PTMs) pueden aumentar en gran medida la diversidad funcional del proteoma cambiando el tamaño, carga, estructura y estado de oligomerización (entre otras características) de las proteínas 1-3. Como resultado, el cambio en la estructura de la proteína puede conducir a consecuencias fisiológicas, tales como la degradación de proteínas, la diferenciación celular, la señalización, la modulación en la expresión génica, y las interacciones proteína-proteína. Mientras que estas modificaciones son frecuentes en un gran porcentaje de todas las proteínas humanas, los extremos terminales de las proteínas histonas se someten a un número inusualmente alto de modificaciones covalentes 4. Las proteínas histonas son una familia de proteínas estructurales que facilitan la condensación del ADN genómico. Las modificaciones covalentes de las colas de las histonas no estructurados se llevan a cabo y regulados por una series de enzimas que pueden catalizar la modificación covalente de residuos (escritores), revertir las mismas modificaciones (borradores), y distinguir entre los cambios que se imprime en las colas de las histonas (lectores) 5-7. De hecho, la mayoría de los PTM conocidos se puede observar dentro de este segmento corto de la histona incluyendo la metilación, fosforilación, acetilación, sumoylation, ubiquitinación, y citrullination 8.
Citrullination implica la conversión de peptidil-arginina a la no t RNA peptidil-citrulina codificada (Figura 1A). Las proteínas, responsables de esta cadena de neutralización lado, son miembros de la PAD (p eptide un d eiminase rginine) familia de proteínas, todos los cuales son enzimas dependientes de calcio. 9,10. Hasta la fecha, cinco miembros de la familia PAD se han descrito (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4, y PAD6). Cada miembro de esta familia aparece a proteínas diana celulares distintas y también muestra uniperfiles de distribución en tejidos Que. PAD4 es el único miembro de esta familia de proteínas conocida por ser localizada dentro del núcleo a través de una secuencia de localización nuclear 11. Por consiguiente, se ha demostrado que deiminate una serie de objetivos nucleares, incluyendo cadenas laterales de arginina en las colas N-terminales de las histonas H2A residuo de arginina 3 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17, y H3R26) y H4 (H4R3) 12, 13. Mientras que cada una de las isoenzimas PAD tienen funciones fisiológicas específicas y críticas, PAD4 ha recibido mucha más atención debido a su papel en un número de procesos humanos en ambas células enfermas y sanas. Recientemente, PAD4 se demostró que era un miembro de la red transcripcional pluripotencia 14. Ambos niveles de expresión y actividad PAD4, se mostró a ser elevados durante la reprogramación y en estado fundamental estados pluripotentes en ratones. Mediante el control de la regulación de los genes de células madre, PAD4 puede retener un papel fundamental en la eficiencia de la reprogramación celular. PAD4 también ha sido implicado en laformación de trampas extracelulares de neutrófilos, que tras la unión de patógenos permitir su depuración de sistema. El hypercitrullination de proteínas histonas por PAD4 induce descondensación de la cromatina, que sirve como material de base para la encapsulación de bacterias patógenas por la trampa extracelular, por lo tanto alejar las infecciones bacterianas 15,16.
Además, PAD4 se ha encontrado para desempeñar un papel activo en un número de enfermedades humanas. Se ha demostrado previamente que la expresión aberrante de PAD4 se asocia con la aparición y severidad de la artritis reumatoide, la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, y esclerosis múltiple 17. De hecho, la presencia de anticuerpos anti-proteína citrulinados es uno de los biomarcadores diagnósticos y pronósticos más confiables y definitivas de la artritis reumatoide 18. Asimismo, la actividad PAD4 dysregulated recientemente se ha observado en un número de cánceres humanos incluyendo ovario, mama, pulmón, unad cánceres esofágicos 19-22. El vínculo entre PAD4 y el cáncer se ha demostrado que ser mediada a través de la oncogén ELK1 o a través de la proteína supresora de tumores p53 22,23 y el trabajo previo ha sugerido que PAD4 podría ser un anti-cáncer de nueva diana terapéutica 17,24,25. Como prueba de principio estudio, el agotamiento de los PAD4 través shRNA en la línea celular de cáncer colorrectal HCT116 fue revelado a ser suficiente para inducir la apoptosis y la detención del ciclo celular 26. Un inhibidor irreversible PAD4 desarrollado recientemente condujo a una reducción del setenta por ciento de la masa tumoral en ratones 27. Muy notablemente, la inhibición PAD4 parecía actuar como una terapia dirigida que resultó en la destrucción selectiva de las células cancerosas sin dañar las células no transformadas.
El uso de moléculas pequeñas para desactivar la función de PAD4 puede llegar a ser una nueva y poderosa estrategia para dirigirse a las células cancerosas o para aumentar quimioterapéuticos de cáncer existentes 28. Por desgracia, un pocarpa inhibidor reversible PAD4 aún no se ha descubierto. Una serie de inhibidores covalentes se han desarrollado utilizando la / mango imidina flúor cloro que imita el sustrato arginina 27,29,30 y han demostrado ser herramientas prácticas para comprender el papel de PAD4 tanto en las células sanas y enfermas estatales. Sin embargo, estas moléculas inhiben todos los PAD activos con potencia similar. Por lo tanto, la necesidad de un ensayo fácil de que informa sobre la actividad de PAD4 es crucial. Hasta la fecha, PAD4 ensayos se han descrito que enlazan la liberación de amoníaco a partir de la reacción a una lectura colorimétrica 31, utilizar un análogo de sustrato chloroamidine marcado con fluorescencia para el ensayo de polarización de fluorescencia 32, se basan en la reacción de ácido asistida entre glioxal y citrulina 33, y par la actividad PAD4 a una fluorescencia desatenuación paso 34. De estos, sólo la estrategia haloacetamidine modificador covalente ha demostrado ser compatible con scre de alto rendimientoplataformas Ening 32,35,36. Se describe un ensayo basado en la fluorescencia superficial que mide de forma fiable la actividad de PAD4. El ensayo, que muestra una fuerte relación señal-ruido, la velocidad de análisis, y la robustez de la medición, tiene el potencial de descubrir un inhibidor de PAD4 verdaderamente potente y selectivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Herein, a fluorescence based assay was successfully developed that monitors the activity of PAD4. The assay has proven to be incredibly robust in a number of high-throughput conditions and is also compatible with whole cell lysates37.
The affinity between the histone proteins and the DNA strands surrounding it loosens due the neutralization of the positive charge on the arginine side chain upon citrullination. It was envisioned that the neutralization of the arginine side-chain coul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Lehigh University Start-up Package. We thank Dr. Walter Fast for providing the GST-PAD4 plasmid for protein expression.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI) | Amresco | J106-2KG | http://www.amresco-inc.com |
| Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP902-25 | http://www.fishersci.com |
| Isopropylthiagalactonse (IPTG) | Life Technogolies | 15529-019 | http://www.lifetechnologies.com |
| All Buffer Salts | Fisher Scientific | N/A | Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc. |
| Protino Glutathione (GSH) agarose | Machery-Nagel | 745500.10 | Store at 4 °C; http://www.mn-net.com/ |
| Z-Arg-Arg-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride (Zcoum) | Sigma Aldrich | C5429 | www.sigmaaldrich.com |
| Chloroamidine | Cayman Chemical | 10599 | Store at -20 °C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP HCl) | Thermo Scientifc | 20490 | http://www.piercenet.com |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | www.sigmaaldrich.com |
| Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384) | N/A | N/A | Purchase from Corning; Sigma-Aldrich |
| Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software | N/A | N/A | www.tecan.com |
| Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter | N/A | N/A | http://www.perkinelmer.com |
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