PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.
Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein substrates. The histone tails represent one of the most heavily modified stretches within all human proteins. Peptidyl-arginine deiminase 4 (PAD4) has been shown to convert arginine residues into the non-genetically encoded citrulline residue. Few assays described to date have been operationally facile with satisfactory sensitivity. Thus, the lack of adequate assays has likely contributed to the absence of potent non-covalent PAD4 inhibitors. Herein a novel fluorescence-based assay that allows for the monitoring of PAD4 activity is described. A pro-fluorescent substrate analog was designed to link PAD4 enzymatic activity to fluorescence liberation upon the addition of the protease trypsin. It was shown that the assay is compatible with high-throughput screening conditions and has a strong signal-to-noise ratio. Furthermore, the assay can also be performed with crude cell lysates containing over-expressed PAD4.
Ett stort antal däggdjursproteiner är starkt modifierat genom verkan av enzymer efter biosyntesen av proteiner genom ribosomen. Dessa post-translationella modifieringar (PTMs) kan öka den funktionella mångfalden av proteomet genom att ändra storlek, laddning, struktur och oligomerisering staten (bland andra funktioner) av proteiner 1-3. Som ett resultat av detta kan förändringar i proteinstrukturen leda till fysiologiska konsekvenser, såsom proteinnedbrytning, cellulär differentiering, signalering, modulering i genexpression, och protein-proteininteraktioner. Även om dessa ändringar är vanliga i en stor andel av alla mänskliga proteiner, avslutar terminalen på histonproteiner genomgår ett ovanligt högt antal kovalenta modifieringar 4. Histonproteiner är en familj av strukturproteiner som underlättar kondensationen av genomiskt DNA. Kovalenta modifieringar av ostrukturerade histon svansar genomförs och regleras av en series av enzymer som kan katalysera kovalent modifiering av rester (författare), vända samma modifieringar (suddgummin), och skilja mellan de förändringar som präglade på histon svansar (läsare) 5-7. I själva verket är de flesta av de kända PTMs kan observeras inom denna korta segment av histon inkluderande metylering, fosforylering, acetylering, sumoylation, ubikvitinering och citrullinering 8.
Citrullinering innebär omvandlingen av peptidyl-arginin till den icke-t-RNA kodad peptidyl-citrullin (Figur 1A). De proteiner, som är ansvariga för denna sidokedja neutralisering, är medlemmar av PAD (p eptide en rginine d eiminase) proteinfamiljen, av vilka alla är kalciumberoende enzymer. 9,10. Hittills har fem medlemmar av PAD familjen beskrivits (Pad1, pad2, PAD3, PAD4 och PAD6). Varje medlem av denna familj verkar rikta distinkta cellulära proteiner och även visar unique vävnadsdistributionsprofiler. PAD4 är den enda medlemmen av denna proteinfamilj känd för att vara lokaliserade i kärnan via en nukleär lokaliseringssekvens 11. Följaktligen har det visats att deiminate ett antal nukleära mål, inklusive arginin sidokedjor på de N-terminala svansar av histoner H2A argininrest 3 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17 och H3R26) och H4 (H4R3) 12, 13. Medan var och en av PAD isozymerna har specifika och viktiga fysiologiska funktioner, har PAD4 fått betydligt mer uppmärksamhet på grund av sin roll i ett antal mänskliga processer i både sjuka och friska celler. Nyligen var PAD4 visat sig vara en medlem av pluripotens transkriptionsnätet 14. Båda PAD4 uttrycksnivåer och aktivitet visade sig vara förhöjda under omprogrammering och mark statliga pluripotenta stater i möss. Genom att styra regleringen av stamcellsgener kan PAD4 behålla en central roll i cellulär omprogrammering effektivitet. PAD4 har också implicerats ibildningen av neutrofila extracellulära fällor, som vid bindning av patogener möjliggöra deras systemintyg. Den hypercitrullination av histonproteiner från PAD4 inducerar decondensation av kromatin, som fungerar som basmaterial för inkapsling av patogena bakterier genom den extracellulära fällan, vilket avvärja bakteriella infektioner 15,16.
Dessutom har PAD4 befunnits spela en aktiv roll i ett antal mänskliga sjukdomar. Man har tidigare visat att onormalt uttryck av PAD4 associeras med uppkomsten och svårighetsgraden av reumatoid artrit, Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom och multipel skleros 17. I själva verket är förekomsten av anti-citrullinerade proteinantikroppar en av de mest pålitliga och definitiva diagnostiska och prognostiska biomarkörer för reumatoid artrit 18. Likaså har dysreglerad PAD4 aktivitet nyligen observerats i ett antal humana cancerformer inklusive äggstocks-, bröst-, lung-, end esophageal cancer 19-22. Kopplingen mellan PAD4 och cancer har visat sig vara medierad via ELK1 onkogenen eller via p53-tumörsuppressorproteinet 22,23 och tidigare arbete har föreslagit att PAD4 skulle kunna vara en ny anticancer terapeutiskt mål 17,24,25. Som ett proof of principle studie utarmning av PAD4 via shRNA i kolorektal cancer cellinje HCT116 visade sig vara tillräckligt för att inducera apoptos och cellcykelstopp 26. En nyligen utvecklad irreversibel PAD4 inhibitor ledde till en minskning i tumörmassa hos möss 27 sjuttio procent. Ganska anmärkningsvärt, verkade PAD4 inhibition att fungera som en målsökande terapi som resulterade i selektiv dödande av cancerceller utan att skada otransformerade celler.
Användningen av små molekyler för att stänga av funktionen för PAD4 kan visa sig vara en kraftfull ny strategi för att rikta cancerceller eller för att förstärka befintliga cancer kemoterapeutika 28. Tyvärr, en potält reversibel PAD4 hämmare har ännu inte upptäckt. Ett antal kovalenta inhibitorer har utvecklats med hjälp av klor / fluor imidine handtag som efterliknar arginin substratet 27,29,30 och har visat sig vara praktiska verktyg för att förstå rollen som PAD4 både hos friska och sjuka statliga celler. Emellertid har dessa molekyler inhiberar alla aktiva kuddar med liknande potens. Därför är behovet av en enkel analys som rapporterar på aktiviteten av PAD4 avgörande. Hittills har PAD4 analyser beskrivits att länka frisättningen av ammoniak från reaktionen till en kolorimetrisk avläsning 31, utnyttjar en fluorescensmärkt chloroamidine substratanalog för fluorescenspolarisationsanalys 32 förlita sig på den syra assisterad reaktion mellan glyoxal och citrullin 33, och koppla PAD4 verksamhet till en fluorescens dequenching steg 34. Av dessa är det bara den kovalenta modifierings haloacetamidine strategi har visat sig vara kompatibel med hög genomströmning skärmening plattformar 32,35,36. Vi beskriver en enkel fluorescensbaserad analys som på ett tillförlitligt sätt mäter aktiviteten av PAD4. Analysen, som visar en stark signal-till-brus-förhållande, analyshastigheten, och robusthet för mätningen, har potential att upptäcka en verkligt effektiv och selektiv PAD4 inhibitor.
Herein, a fluorescence based assay was successfully developed that monitors the activity of PAD4. The assay has proven to be incredibly robust in a number of high-throughput conditions and is also compatible with whole cell lysates37.
The affinity between the histone proteins and the DNA strands surrounding it loosens due the neutralization of the positive charge on the arginine side chain upon citrullination. It was envisioned that the neutralization of the arginine side-chain coul…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Lehigh University Start-up Package. We thank Dr. Walter Fast for providing the GST-PAD4 plasmid for protein expression.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI) | Amresco | J106-2KG | http://www.amresco-inc.com |
Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP902-25 | http://www.fishersci.com |
Isopropylthiagalactonse (IPTG) | Life Technogolies | 15529-019 | http://www.lifetechnologies.com |
All Buffer Salts | Fisher Scientific | N/A | Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc. |
Protino Glutathione (GSH) agarose | Machery-Nagel | 745500.10 | Store at 4 °C; http://www.mn-net.com/ |
Z-Arg-Arg-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride (Zcoum) | Sigma Aldrich | C5429 | www.sigmaaldrich.com |
Chloroamidine | Cayman Chemical | 10599 | Store at -20 °C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP HCl) | Thermo Scientifc | 20490 | http://www.piercenet.com |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | www.sigmaaldrich.com |
Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384) | N/A | N/A | Purchase from Corning; Sigma-Aldrich |
Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software | N/A | N/A | www.tecan.com |
Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter | N/A | N/A | http://www.perkinelmer.com |