여기서는 조사자 마우스 순환계 유래 내피 부착 분자로 코팅 챔버를 연결하여 백혈구 보충 생체 역학을 평가할 수 있도록하는 프로토콜을 제시한다. 이 상대적인 생물학적 조건하에 백혈구 평가 가능 때문에이 방법은 상당한 이점을 제공한다.
백혈구 – 내피 상호 작용은 급성 및 만성 염증의 초기에 중요한 이벤트이며, 조절 곤란하면, 영구 병리학 적 손상으로 이어지는 조직 손상을 중재 할 수 있습니다. 기존의 종래 분석법은 혈액으로부터 백혈구 추출 후 백혈구 부착 분자의 분석을 허용한다. 이는 말초 혈액 백혈구 (말초 혈액 림프구)가 차례로 연구 결과에 영향을 미치는 말초 혈액 림프구를 자극 할 수있는 분석을위한 준비를하기 전에 몇 가지 단계를 받아야하는 혈액이 필요합니다. autoperfused 마이크로 흐름 챔버 분석은, 그러나, 과학자들은 코팅 챔버를 조작하는 자유를하면서 라이브 마우스의 전신 흐름을 사용하여 기능 조절 장애 초기 백혈구를 연구 할 수 있습니다. 질병 모델을 통해, 백혈구 부착 분자의 기능적 발현을 평가할 수있다 고정화 내피 세포 부착 분자 생체 코팅 유리 마이크로 챔버 정량화. 이 모델에서 혈액 흐름챔버 내의 네이티브 말초 혈액 림프구의 상호 작용을 허용 우측 총 경동맥과 마취 살아있는 마우스의 왼쪽 외부 경정맥 사이. 실시간 분석 실험은 생체 내에 현미경의 도움뿐만 아니라 하버드 장치 압력 장치에 의해 달성된다. 유리 챔버의 입력 시점에서 유동 조절기의 어플리케이션의 사이에 유사한 생리 학적 실험 유량 조건을 허용한다. 백혈구 롤링 속도는 주요 결과이며, 건강 오픈 액세스 소프트웨어 ImageJ에 국립 연구소를 사용하여 측정한다. 요약하면, autoperfused 마이크로 흐름 챔버 분석은 백혈구를 내피 세포의 상호 작용을 연구하는 최적의 생리 학적 환경을 제공하고 염증을 연구 할 때 연구자는 정확한 결론을 도출 할 수 있습니다.
염증은 손상에 대한 신체의 보편적 인 반응이다 모두 선천성 및 후천성 면역 시스템 기능에 중요한 단계입니다. 부상 및 / 또는 염증성 자극에 응답하여, 특정 내피 세포 부착 분자를 상향 조절; 이것은 주로 후 모세관 세정맥에, 미세 혈관 내피 세포를 통해 혈관 외 유출을 백혈구에 이르게. 이 과정은 내피 세포에 혈류의 자유 흐르는 백혈구의 테 더링으로 시작합니다. 안정 압연 및 다시 윤회와 세포 독성 제의 분비로 연결 백혈구의 밀착성이가 1,2 테 더링 따릅니다. 셀렉틴은 계단식 3-5의 초기 단계를 매개하는 것으로 알려져있다; 인테그린은 회사의 부착과 윤회 1,6-8의 이후 단계에 대한 책임이 있습니다.
증거의 성장 몸은 허혈 재관류 손상 동물 모델에서 백혈구와 내피 세포 부착 분자가 중요한 역할을 제안합니다천식, 건선, 다발성 경화증, 및 연령 관련 황반 변성증 9-12. 이러한 조건 하에서, 염증 반응은 건강한 조직의 파괴의 결과, 자신의 몸을 공격하는 오 분사된다. (예를 들면 비 스테로이드 성 항염증제, 코르티코 스테로이드 또는 다른 화학 요법 제와 같은) 기존의 항염증제는 장기 사용 (13)으로 심각한 부작용의 위험을 수행한다. 따라서, 비 – 독성을 유지하면서 14 궁극적으로 목적하는 항 염증 효과가 대상이 될 수있는 질병 특정한 분자를 식별하는 능력을 가진 적절한 도구를 가지고 큰 관심사이다.
이러한 정적 백혈구 유착 검정 시험 관내 방법으로서 기존 빠르면 1976 15로 하였다. 병류 챔버는 제 1 유동 조건에서 백혈구의 내피 상호 작용을 연구하기 위해 1987 년에 시험 관내에서 사용 하였다. 이들 실험에서, 구호 물자를 자극N 정맥혈에서 다형 핵 백혈구 (백혈구)는 기본 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC를)의 단층을 통해 관류 하였다. 혈역학 유동 조건에 대해 제어하기 위해 하버드 장치 주사기 펌프 (16)를 사용 하였다. 대안 적으로, 인공 백혈구 분리를 피하기 위해, 전혈 고정화 부착 분자 (17)로 코팅 된 유리 용기와 조합하여 사용 하였다.
백혈구 자극을 방지하고 기계적으로 대략적인 생리적 조건에서 부착 분자와의 상호 작용을 연구하기 위해, 생체 autoperfused, extracorporal은, 동정맥 회로 (16)를 개발 하였다. 이 회로에서 혈액 단일 또는 공동 고정화 부착 분자로 코팅 된 유리 마이크로 플로우 챔버 내에 네이티브 말초 혈액 림프구의 상호 작용을 가능하게 마취 살아있는 마우스의 우측 총 경동맥과 좌측 외부 경정맥 사이에 흐른다. 이 정기적 복용하기에 가장 큰 장점m은 염증 경로가 직접 또는 간접적으로 조작하는 유전자 조작 된 마우스를 사용하는 능력이다. 또한, 유동 조건 하에서, 외부의 자유 활성 염증, 백혈구 부착 분자의 격리 기여를 정확하게 할 수있는 능력이있다. 유동 챔버의 입력 시점에서 유동 조절기의 애플리케이션은 동맥 또는 정맥 시스템 18-22를 모방하는 전단력의 실험 변동 폭넓게 제공한다. 여기에서 우리는 훌륭한 세부 사항에 생체 autoperfused 마이크로 플로우 챔버 분석의 준비와 성능에 관한 프로토콜을 설명합니다.
백혈구 보충 프로세스는 염증 반응에서 중요한 단계이다; 이것은 그들이 그들의 작동 자 기능을 발휘할 수있는 표적 조직쪽으로 순환계에서 백혈구의 이동을 수반한다. 백혈구 보충은 죽상 경화성 플라크, 심근 경색, 허혈 / 재관류 및 이식 수술 일뿐만 아니라, 여러 CNS 관련 신경 염증성 질환 같은 염증성 10-12,20,24,25 다양한 조건에서 적분된다. 백혈구 보충 스팬은 autoperfused 마이크로 플로우 챔버는 조사자 백혈구 이주 역학을 연구 할 수있는 능력을 허용하는 필수 불가결 한 도구를 제공하는 질병 상태의 다양성을 고려.
지난 수십 년간, 시험 관내 검정법 다양한 백혈구 세포 유착 (26)의 동역학을 연구하기 위해 개발되었다. 불행히도, 이러한 모든 분석의 추출을 필요혈액에서 백혈구, 기계 활성화를 소개합니다. 생체 내 환경에 근접하게, 적응은 전혈 시료를 수집하고 혈역학 유동 조건 (16, 17)를 제어하도록 하였다. 여기서는 마우스 순환 시스템으로 코팅 챔버를 연결하여 필드 이전 발전을 연장한다. 우리는 생리적 범위로 혈액의 흐름을 조절하고 백혈구 롤링의 역학을 연구 할 수 있습니다. 코팅 챔버는 우리에게 특정 접착 분자와 백혈구의 상호 작용을 연구 할 수있는 기능을 제공합니다. 시스템이 살아있는 마우스에 의해 조작 수단으로서 기능하기 때문에,보다 밀접 우리 면역 마우스 모델의 다양한 백혈구 – 내피 세포 상호 작용을 연구 할 수 있도록, 자연 환경을 모방. 또한,이 시스템은 우리가 제공되는 다중 유전자 마우스 모델을 활용할 수있다. 시스템이 완전히 생체 환경을 복제하지 않지만, 그것은보고 특정을 연구하는 플랫폼을 제공한다생리적 조건에서 백혈구의 C 원소, 이전에 가능하지 않았다 묘기. 이 걸음 더 가까이 더 생리적 환경에 우리를 데려 간다하더라도 시스템에 대한 제한 사항이 있습니다. 우리가 실 코팅으로 제한됩니다 백혈구 상호 작용의 특정 요소를 평가하는 유일한 수 있도록 완전히 혈관의 복잡한 3D 매트릭스를 복제하지 않습니다. 게다가,주의 깊게 프로토콜에서 언급 된 모든 단계에 따라 마우스의 순환하는 폐쇄 시스템을 확인해야한다. 기포의 도입은 크게 실험의 재현성 및 정확성에 영향을 미칠 것이다.
우리는 백혈구 롤링 역학을 평가 Autoperfused 마이크로 플로우 챔버의 사용을 설명하지만 절차는 다양한 질환을 연구 수사관 개인화 될 가능성이있다. 예를 들어, 암 세포는 백혈구 공유 공통 인테그린 많은 표현함으로써 전이. 나머지 공부g 더 가깝게 우리의 지식에 도움이 될 수있는 생체 내 환경을 모방 설정 및 특정 암 세포 침입의 가능성이 자연 예측에서의 롤링 역학. 하나의 가능한 접근법은 GFP를 발현하는 암세포의 롤링 역학을 추적하는 유량 용기 분석과 함께, 예컨대 27과 GFP 암세포에 대해 라벨링 기술을 결합 할 수있다. 그것은이 절차가 유전자 변형 마우스 및 질병 모델과 함께 다른 실험실에서 사용하기 위해 수정 방식을 볼 수 흥미로운 일이 될 것이다 물질의 다양한 챔버를 코팅과 같은 마우스에 여러 개의 챔버를 연결의 유연성을 감안할 때. 우리가 여기에서 설명하는 기술은 오직 연구자의 창의성에 의해 제한된다 훨씬 광범위한 응용 가능성에 감동.
The authors have nothing to disclose.
R01EY022084 / S1 (KMC), T32EY007145 (HS) 및 P30EY014104 :이 책에서보고 된 연구는 보너스 번호에 따라 국립 보건원 (NIH)의 국립 안과 연구소에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다. 추가 지원은 매사추세츠 라이온스 안구 연구 기금 (KMC)와 (KMC에) 실명 예방 연구에서 특별 장학생 상에 의해 제공되었다.
Material | Vendor | Part number |
Micro glass chamber 0.4×0.04x50mm | VitroCom | 2540-050 |
Polyethylene tubing PE 10 | Fisher Scientific | 427400 |
Polyethylene tubing PE 60 | Fisher Scientific | 427416 |
Silicone tubing 002 | Fisher Scientific | 11-189-15A |
Y tube | Value Plastics | Y210-6 |
T tube | value plastics | T410-6 |
Silicone gel | Hardware store – Home Depo | |
35mm petri dish | Corning | 430165 |
Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM996 |
Fine forceps | FST | 11253-25 |
Fine scissors | FST | 15000-08 |
Tube holder | FST | 00608-11 |
Clamp applicator | FST | 18057-14 |
Vascular clamp | FST | 18055-04 |
6-0 silk sutures | George Tiemann & Co | 160-1215-6/0 |
25x1G needles | BD | 305125 |
30×1/2G needles | BD | 305106 |
Heparin 100 USP units/ml | Hospital pharmacy |