טכניקת הארכת פריימר בהתבסס הקרינה לקביעת נקודות התחלת תעתיק ומחשוף אתרים של RNases<em> In vivo</em
Summary
We here describe a fluorescence based primer extension method to determine transcriptional starting points from bacterial transcripts and RNA processing in vivo using an automated gel sequencer.
Abstract
הארכת הקרינה מבוססת פריימר (FPE) היא שיטה מולקולרית כדי לקבוע נקודת התחלת שעתוק או אתרי עיבוד של מולקולות RNA. זו מושגת על ידי שעתוק לאחור של ה- RNA של עניין באמצעות פריימרים שכותרתו fluorescently ספציפיים וניתוח בדיעבד של שברי cDNA וכתוצאה מכך על ידי denaturing ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide. במקביל, תגובה סנגר רצף מסורתי מנוהלת על הג'ל למפות את הקצוות של שברי cDNA לבסיסים המקביל המדויקים שלהם. בניגוד ל5'-RACE (Rapid ההגברה של קצות cDNA), שבו המוצר חייב להיות משובט ומספר מועמדים רבים רצף, התפזורת של שברי cDNA נוצרו על ידי סיומת פריימר יכולה להתגלות בו זמנית בטווח ג'ל אחד. בנוסף, ההליך כולו (משעתוק לאחור לניתוח סופי של התוצאות) ניתן להשלים ביום עבודה אחד. על ידי שימוש בפריימרים שכותרתו fluorescently, השימוש באיזוטופ רדיואקטיבי מסוכן שכותרתו חומרים כימייםניתן להימנע וזמני עיבוד צומצמו ניתן לאתר מוצרים במהלך הליך אלקטרופורזה.
בפרוטוקול הבא, אנו מתארים שיטת סיומת פריימר ניאון in vivo באופן מהיר כדי לזהות קצוות '5 של RNAs להסיק תעתיק נקודות התחלה ואתרי עיבוד RNA (למשל, על ידי רכיבי מערכת רעלן-אַנְטִיטוֹקסִין) בס aureus, E. coli וחיידקים אחרים.
Introduction
סיומת פריימר 1 היא שיטה מולקולרית כדי לקבוע קצוות '5 של מולקולות RNA ספציפיות עד רזולוציה בסיסית אחד. היתרון לשיטות אחרות כגון 5'-RACE (הגברה מהירה של cDNA מסתיימת) הוא זמן אספקה המהיר והיכולת לנתח תערובת של אורכים שונים של מולקולות RNA בקלות.
שיטה זו פועלת על ידי חשיפת מולקולות RNA להפוך תגובות שעתוק באמצעות פריימרים ספציפיים ניאון, יצירה שברי cDNA של אורכים מסוימים. מולקולות cDNA אלה לרוץ לצד תגובות סנגר רצף מסורתי 2 על ג'לים polyacrylamide denaturing ויכולות להיות מזוהות על ידי הקרינה שלהם בשל השימוש בפריימרים שכותרתו fluorescently. האורכים של ברי cDNA מוערכים על ידי השוואה לסולם הרצף, המאפשרים המיפוי של 5 קצות RNA ".
באופן מסורתי, תגובות סיומת פריימר משמשות בשילובעם איזוטופים רדיואקטיביים לזיהוי תרכובות cDNA על צילומי רנטגן. בשל סכנות בריאותיות, בעיות סילוק פסולת ולהקל על טיפול, פרוטוקולים חדשים יותר לנצל הקרינה לגילוי סיומת פריימר עם sequencers האוטומטי, אם כי הרגישות שלהם נמוכה במקצת. באמצעות פריימרים שכותרתו fluorescently, ניתן להשמיט את הליך רדיו תיוג החוזר, כצבעי יסוד ניאון הם יציבים במשך זמן רב (יותר משנה בידיים שלנו).
השיטה שאנו מתארים כאן מנצלת רצף ג'ל אוטומטי, אך עם שינויים קלים, sequencers נימים יכול לשמש גם להפרדת cDNA וגילוי 3. הטבע המקביל של ניתוח ג'ל מאפשר לזהות אפילו כמות קטנה של מחשוף RNA או עיבוד. יתרון נוסף הוא ברזולוציה הגבוהה של שיטה זו, כמחשוף או עיבוד של אף אחד בסיס מסוף ניתן לאתרם.
בהקשר לזיהוי של מחשוף RNA או עיבוד, typically שני סוגים שונים של הרחבות פריימר הם מכובדים. במקרה אחד, הטיפול אנזימטי נעשה במבחנה באמצעות RNA מטוהר ואנזים מטוהר, ואילו במקרה האחר, העיבוד נעשה in vivo ו- RNA וכתוצאה מכך הוא מטוהרים. בשני המקרים RNA הוא נתון לרחבת פריימר בוצעה במבחנה, עם זאת, בהתאם למקור של RNA, השיטה היא גם נקראת סיומת פריימר vivo במבחנה או ב. בפרוטוקול אנו מציגים כאן, אנו מתמקדים אך ורק על in vivo סיומת פריימר, בגלל קלות שימוש (אין חלבונים מטוהרים צורך) ואת האפשרות לקבוע נקודות התחלת תעתיק ועיבוד באותו הזמן. עם זאת, במבחנה הרחבות פריימר באופן עקרוני להגדיר באותה הצורה ופרוטוקול זה יכול לשמש כנקודת התחלה.
השיטה מאוירת כאן יכולה להיות מיושמת על מינים רבים של חיידקים, כל עוד הם ניתנים לגבוהיםהכנת טוהר ותשואה גבוהה של חומצות גרעין.
המחקר במעבדה שלנו מתמקד בהיקף הרגולציה של מערכות רעלן-נסיוב (ת א) 4,5, תחום שבו נעשתה שימוש נרחב בשיטת הרחבה פריימר. מדד ת"א מערכות אלמנטים גנטיים קטנים הנמצאים בגנומים פרוקריוטים שמורכבים מחלבון רעיל יציב ואופן אנדוגני פעיל וחיסון אנטי-חלבון או RNA בעיקר לא יציב שמנטרל רעילות 6,7. לפעמים פעילות רעלן מופעלת על ידי עיכוב של שכפול, סינתזת דופן תא או מנגנונים אחרים, אבל לרוב על ידי פעילות RNase 8,9. בדרך כלל, סגוליות RNase נקבע על ידי ביצוע בדיקות שונות, שאחד מהם היא שיטת סיומת פריימר. תגובות סיומת פריימר הם גם מתאימות ליישום זה, כתערובת של שברי אורך בקעו ומלאים ניתן לנתח בו זמנית כדי לקבוע את '5 מסתיים. באמצעות שילוב של במבחנה וברחבות פריימר vivo,מחשוף RNase רעלן ספציפי, לדוגמא, ניתן לקבוע סגוליות רצף 10-13.
איור 1. סקירה כללית של הליך סיומת פריימר. תרבויות חיידקים מודגרת וטופלו בהתאם לצרכי הניסוי. RNA סה"כ מופק מהתאים, שטופל בDNase אני כדי להסיר עקבות DNA ונתונים לתגובת שעתוק לאחור באמצעות פריימרים יעד ספציפיים ניאון DNA מניב cDNA. DNA או פלסמידים הגנומי מופקים ולאחר מכן משמש לתגובות סנגר רצף ניאון להשוואת גודל עם שברי cDNA. מוצרי סיומת פריימר מנוהלים על צד מוצרים סנגר רצף על ג'ל polyacrylamide האוריאה denaturing וניתחו עם לייזר ומיקרוסקופ אוטומטיים. בסיס הרצף ששורות עם להקת cDNA הוא להרח בסיס של 5 סוף cDNA '(החץ הכחול). מידע נוסף ב Fekete, et al. 3 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ניתן למצוא סקירה של ההליך כולו סיומת פריימר באיור 1. בקצרה, תאי חיידקים בתרבית, שנקטפו, התא גלולה lysed וRNA חילוץ. RNA המטוהר לאחר מכן טופל בDNase אני כדי להסיר עקבות של מולקולות DNA אשר יכול לפעול כתבניות לטרנסקריפטאז ההפוך. פריימרים ניאון ספציפיים מתווספים ל- RNA, כלאה אל האזור של עניין, ולאחר מכן להפוך את תמלילי עדויות, וכתוצאה מכך דנ"א יחיד שנתקע משלים (cDNA). סולם רצף נוצר על ידי סנגר רצף מסורתי העסקת פריימרים ניאון ומופרד על ג'ל polyacrylamide denaturing צד של שברי cDNA סיומת פריימר. וכתוצאה מכךג'ל מנותח על ידי השוואת להקות ניאון, המאפשרת זיהוי של קצוות '5 של עניין. נקודות התחלת תעתיק ואתרי עיבוד מוערכים בנפרד על-ידי השוואות רצף.
Protocol
Representative Results
Discussion
סיומת פריימר ניאון היא שיטה פשוטה ומהירה לקביעת קצוות "5 של RNA, או לTSP- או הזדהות עיבוד RNA משנית. בשל השימוש בצבעי יסוד ניאון, ניתן להגדיר את התגובות ולרוץ ללא אמצעי אבטחה נוסף (שלא כמו במקרה של פריימרים שכותרתו רדיואקטיבית). כדגימות זוהו על ידי הקרינה, הם יכולים להיות ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Anne Wochele for her assistance in the laboratory and Vera Augsburger for help with the automated gel sequencer. We thank the Deutsche Forschungsgemeinschaft for funding by grants BE4038/2 and BE4038/5 within the “priority programmes” SPP1316 and SPP1617.
Materials
| Name | Supplier | Catalog Number(s) | Comment |
| AMV Reverse Transcriptase (20-25 U/µl) | NEB / Roche | NEB: M0277-T / Roche: 10109118001 | |
| DNase I (RNase free) | Ambion (life technologies) | AM2222 | |
| FastPrep-24 Instrument | MPBio | 116004500 | |
| Fluorescently labeled primers | Biomers | n/a | 5’ DY-681 modification of “ordinary” DNA oligonucleotides. Compatible dyes such as the LICOR IRDye 700/800 are also available from other suppliers such as IDTdna. |
| Li-Cor 4200 Sequencer incl. ImagIR Data collection software | Li-Cor | Product discontinued | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| Nuclease free water | Ambion (life technologies) | AM9915G | |
| Plasmid mini preparation kit | QIAGEN | 12125 | |
| RapidGel-XL-40% Concentrate | USB | US75863 | |
| RNA STORAGE BUFFER | Ambion (life technologies) | AM7000 | |
| Roti-Aqua-P/C/I | Carl Roth | X985.3 | Alternative: “Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)” from Ambion (AM9720) |
| SUPERase•In RNase Inhibitor | Ambion (life technologies) | AM2696 | |
| Thermo Sequenase fluorescently labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP | GE Healthcare | RPN2538 | |
| TRIzol reagent | life technologies | 15596-026 | |
| Zirconia/Silica Beads 0.1 mm | BioSpec | 11079101z |
References
- Simpson, C. G., Brown, J. W. Primer extension assay. Methods Mol. Biol. 49, 249-256 (1995).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463-5467 (1977).
- Fekete, R. A., Miller, M. J., Chattoraj, D. K. Fluorescently labeled oligonucleotide extension: a rapid and quantitative protocol for primer extension. Biotechniques. 35, 90-94 (2003).
- Schuster, C. F., et al. Characterization of a mazEF Toxin-Antitoxin Homologue from Staphylococcus equorum. J. Bacteriol. 195, 115-125 (2013).
- Nolle, N., Schuster, C. F., Bertram, R. Two paralogous yefM-yoeB loci from Staphylococcus equorum encode functional toxin-antitoxin systems. Microbiology. 159, 1575-1585 (2013).
- Yamaguchi, Y., Park, J. H., Inouye, M. Toxin-antitoxin systems in bacteria and archaea. Annu. Rev. Genet. 45, 61-79 (2011).
- Schuster, C. F., Bertram, R. Toxin-antitoxin systems are ubiquitous and versatile modulators of prokaryotic cell fate. FEMS Microbiol. Lett. 340, 73-85 (2013).
- Goeders, N., Van Melderen, L. Toxin-antitoxin systems as multilevel interaction systems. Toxins. 6, 304-324 (2014).
- Yamaguchi, Y., Inouye, M. mRNA interferases, sequence-specific endoribonucleases from the toxin-antitoxin systems. Progress in molecular biology and translational science. 85, 467-500 (2009).
- Park, J. H., Yamaguchi, Y., Inouye, M. Bacillus subtilis MazF-bs (EndoA) is a UACAU-specific mRNA interferase. FEBS Lett. 585, 2526-2532 (2011).
- Zhu, L., et al. et al.Staphylococcus aureus MazF specifically cleaves a pentad sequence, UACAU, which is unusually abundant in the mRNA for pathogenic adhesive factor SraP. J. Bacteriol. 191, 3248-3255 (2009).
- Zhu, L., et al. The mRNA interferases, MazF-mt3 and MazF-mt7 from Mycobacterium tuberculosis target unique pentad sequences in single-stranded RNA. Mol. Microbiol. 69, 559-569 (2008).
- Fu, Z., Donegan, N. P., Memmi, G., Cheung, A. L. Characterization of MazFSa, an endoribonuclease from Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 189, 8871-8879 (2007).
- Marmur, J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms. J. Mol. Biol. 3, 208-218 (1961).
- Emory, S. A., Belasco, J. G. The ompA 5′ untranslated RNA segment functions in Escherichia coli as a growth-rate-regulated mRNA stabilizer whose activity is unrelated to translational efficiency. J. Bacteriol. 172, 4472-4481 (1990).
- Cole, S. T., Bremer, E., Hindennach, I., Henning, U. Characterisation of the promoters for the ompA gene which encodes a major outer membrane protein of Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 188, 472-479 (1982).
- Schleifer, K. H., Kilpper-Bälz, R., Devriese, L. Staphylococcus arlettae sp. nov., S. equorum sp. nov. and S. kloosii sp. nov.: Three New Coagulase-Negative, Novobiocin-Resistant Species from Animals. Syst. Appl. Microbiol. 5, 501-509 .
- Yu, H., Goodman, M. F. Comparison of HIV-1 and avian myeloblastosis virus reverse transcriptase fidelity on RNA and DNA templates. J. Biol. Chem. 267, 10888-10896 (1992).
- Ying, B. W., Fourmy, D., Yoshizawa, S. Substitution of the use of radioactivity by fluorescence for biochemical studies of RNA. RNA. 13, 2042-2050 (2007).
