הקרינה-מרווה של Fluorophore הקרוב אינפרא אדום-כמוס liposomal ככלי ל<em> In vivo</em> דימות אופטי
Summary
The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.
Abstract
Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.
Introduction
ליפוזומים נחקרו באינטנסיביות ויהוו את אחד ממערכות אספקת הסמים ביו-רפואיות ביולוגית ביותר עבור יישומים קליניים 1,2. הם מורכבים בעיקר מפוספוליפידים וכולסטרול, אשר שניהם תרכובות ביולוגית מחקה חלקים של קרום תא טבעי. אילו יכולים לנפול בפח חומרים הידרופילי בפנים המימי, ניתן לשלב סוכני lipophilic בתוך bilayer פוספוליפידים liposomal 3. Encapsulation של חומרים בתוך הפנים מימיים של יפוזומים מעניק הגנה מפני השפלה in vivo וגם מונע המערכת המארחת מהשפעות רעילות של תרופות ציטוטוקסיות המשמשות לטיפול במחלות, לדוגמא chemotherapeutics נועד להשמיד תאים סרטניים. השינוי של פני השטח liposomal עם פולימרים כמו polyethylenglycol (PEGylation) מרחיב עוד יותר את זמן זרימת דם liposomal in vivo בשל התייצבות sterical 4. Moreovאה, ליפוזומים יכולים לעקל ריכוזים גבוהים של מספר חומרים כגון חלבונים 5,6, חומרים הידרופילי 7,8 ואנזימים 9. לכן הם משמשים כלים טיפוליים ואבחון קליניים אמינות כמו שיזכו לאישורם למשלוח של תרופות ציטוטוקסיות כגון דוקסורוביצין לטיפול בסרטן 4. בשל הגמישות שלהם, יכולים גם להיות טעונים יפוזומים עם fluorochromes למטרות אבחון וניתוחיים מונחות הדמיה.
הדמיה הקרינה מספקת חסכוני ולא פולשנית בכלי אבחון vivo שלעומת זאת, דורשים כמה דרישות בסיסיות. זה יכול להיות הוכיח כי יש לי fluorochromes שיתאים להדמית in vivo קליטה אופיינית ומקסימום פליטה בטווח שבי פיזור האור והפיזור, כמו גם autofluorescence רקמות שמקורן במים והמוגלובין נמוך. לפיכך, יש בדיקות כאלה מקסימום שרירי הבטן / em בין 650 ל 900 ננומטר 10. חוץ מזה, את היציבות של fluorochromes הן במבחנה in vivo היא קריטית, כמו opsonization ופינוי מהיר יכולים להגביל את בקשתם לin vivo הדמיה 11 מאוד. השפעות אחרות כגון יציבות עניה ורגישות נמוכה או תופעות רעילות לתאים באברי מטרה כפי שניתן לראות בירוק Indocyanine (ICG) 12-16, אינן רצויות ויש לקחת בחשבון בעת תכנון בדיקות הדמיה in vivo. תצפיות אלה הובילו לפיתוח הפעיל של כמה fluorochromes פרה-קליני NIR, חלקיקים, כמו גם טכניקות חדשות להדמית in vivo של תהליכים דלקתיים, סרטן ולניתוחי מונחי תמונה 17-20. למרות היציבות ביותר (הקרינה תת-אדום הקרובה) NIRF פרה-קליני צבעים במבחנה, זלוף המהיר והסליקה דרך הכבד והכליות לעכב את השימוש שלהם בהדמיה האופטית in vivo של מחלות ותהליכים דלקתיים.
ntent "> לכן אנו מציגים פרוטוקול לאנקפסולציה של fluorochromes כגון מאופיין היטב קרוב אינפרא אדום צבע פלואורסצנטי DY-676-COOH, ידוע בנטייתה להרוות עצמי בריכוזים גבוהים יחסית 21 ביפוזומים. בריכוזים גבוהים H- היווצרות ו / או דימר ואינטראקציות בין מולקולות fluorophore ממוקמות בתוך תוצאת רדיוס פורסטר של זה בהעברת פורסטר אנרגיית תהודה (סריג) בין מולקולות fluorochrome. בריכוז נמוך המרחב שבין עליות מולקולות fluorophore, ובכך למנוע אינטראקציה לערום-pi לערום-pi H-דימר היווצרות וכתוצאה מכך פליטת הקרינה גבוהה. מעבר בין ריכוז הגבוה ונמוך ומרווית הקרינה הליווי וההפעלה הוא אסטרטגיה מבטיחה שניתן לנצל להדמיה אופטית 22. במובן זה, אנקפסולציה של ריכוזים גבוהים של צבע NIRF DY-676-COOH בפנים המימי של יפוזומים הוא יותר favorable הדמיה in vivo מהצבע החופשי. האתגר של השיטה טמונה קודם כל באנקפסולציה הנכונה ושנית, באימות של היתרונות הנובעים ממתמצתים ריכוזים גבוהים של הצבע. השוואת תכונות ההדמיה של יפוזומים הרווה עם זה של הצבע החופשי וגם עם ניסוח liposome-הרווה אינה עם ריכוזים נמוכים של הצבע היא הכרחית. אנחנו מראים בפרוטוקול לחות סרט וחול פשוט, אך יעיל מאוד בשילוב עם מחזורי הקפאה והפשרה חלופיים שאנקפסולציה של ריכוזי מרווה של DY-676-COOH ביפוזומים אינה ריאלי. שיטות אחרות המשמשות להכנה ליפוזומים כגון שיטת השלב ההפוך אידוי 23, כמו גם את שיטת הזרקת אתנול 24 לאפשר הכנת liposome עם יעילות אנקפסולציה גבוהה עבור רבים חומרים הידרופילי. עם זאת, טבעו של החומר להיות במארז יכול להשפיע על יעילות אנקפסולציה. למעשה,פרוטוקול לחות סרט וחול שהוצג כאן גילה את היעילות הגבוהה ביותר לאנקפסולציה של DY-676-COOH. כדי להמחיש את היתרונות של אנקפסולציה liposomal של DY-676-COOH, מודל בצקת נגרם על zymosan, המאפשר חקר תהליכים דלקתיים בתוך כמה שעות, היה בשימוש. כאן, הוא הוכיח כי ליפוזומים עם ריכוזים גבוהים של DY-676-COOH במארז מתאימים יותר לכל גוף בהדמיה אופטית vivo של תהליכים דלקתיים מאשר לצבוע בחינם או ניסוח liposomal-הרווה אינה עם ריכוזי צבע נמוכים. כך הפרוטוקול הבסיסי מספק שיטה פשוטה ומהירה כדי לייצר ליפוזומים ניאון הרווה והאימות של פוטנציאל ההפעלה והדמיה שלהם הן במבחנה in vivo.Protocol
Representative Results
Discussion
מאז יפוזומים גם יכולים לשמש כמערכות אספקה לצבעי ניאון, הם מאפשרים הדמיה של מחלות יעד. אנקפסולציה של ריכוזים גבוהים של צבעי ניאון כגון צבע NIRF, DY676-COOH משמש כאן, מובילה לרמה גבוהה של מרווה הקרינה של הצבע וממולכד. מרווה הקרינה, תופעה ראתה עם fluorophores רבות בריכוז גבוה יכול?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי HI-698 / 10-1 Deutsche Forschungsgemeinschaft וRU-1,652 / 1-1. אנו מודים לדורין מאי לקבלת סיוע טכני מעולה והחברה DYOMICS GmbH, Jena על תמיכתם.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Materials and equipments for preparation of liposomes | |||
| egg phospahtidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051P | Dissolve in Chloroform and store in glass vials (214 mg/ml) |
| cholesterol | Sigma | C8667 | Dissolve in Chloroform and store in glass vials (134 mg/ml) |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880120P | Dissolve in Chloroform and store in glass vials (122 mg/ml) |
| 1,2-dioleoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 810145P | Dissolve in Chloroform and store in glass vials (2mg/ml) |
| Sartorius MC1 (d = 0.01 mg) | Sartorius AG | Research RC 210 P | used for weighing the phospholipids |
| Rotavapor | Büchi Labortechnik AG | R-114 | used for hydration of phospholipid film |
| Waterbath | Büchi Labortechnik AG | R-481 | used for hydration of phospholipid film |
| Vacuum Controller | Büchi Labortechnik AG | B-720 | used for hydration of phospholipid film |
| Vacobox | Büchi Labortechnik AG | B-177 | used for hydration of phospholipid film |
| Circulation Chiller | LAUDA DR. R. WOBSER GMBH & CO. KG |
WKL 230 | used for hydration of phospholipid film |
| DY-676-COOH | Dyomics GmbH | 676-00 | Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20°C |
| Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan | Applichem | A1086 | buffer 10 mM, pH 7.4 |
| Trichlormethan | Carl Roth GmbH + Co. KG | Y015.2 | used for liposome preparation |
| Sonicator | Merck Eurolab GmbH | USR 170 H | used for liposome preparation |
| Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00) | Scientific Industries Inc. | SI-0256 | used for liposome preparation |
| Sephadex G25 medium | GE Healthcare Europe GmbH | 17-0033-01 | used for liposome purification |
| Triton X100 | Ferak Berlin GmbH | 505002 | used to destruct liposomes for dye quantification |
| LiposoFast-Basic | Avestin Inc. | used for the extrusion of liposomes | |
| Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U) | VWR | used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic | |
| Fluostar Optima | BMG Labtech | used for dye quantification | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | used for the determination of liposome size and zetapotential | |
| Ultracentrifuge | Beckmann Coulter GmbH | XL 80 | used for concentration of the samples |
| Rotor | Beckmann Coulter GmbH | SW 55 TI | used for concentration of the samples |
| Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging | |||
| Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae | Sigma | Z4250-250MG | used for induction of inflammation |
| Isotonic Saline (0.9) | Fresenius GmbH | PZN-2159621 | used for the dilution of Zymosan-A |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda Isotec 4 | used for anesthesizing animals | |
| Isoflurane | Actavis GmbH | PZN-7253744 | anesthesia |
| Thermo Mat Pro 20 W | Lucky Reptile | 61202-HTP-20 | used to keep animals warm during anesthesia |
| Omnican-F (1 ml injection) | Braun | PZN-3115465 | used for subcutaneous and intravenous application of probes |
| Panthenol eye cream | Jenapharm | PZN-3524531 | used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia |
| Hanks buffered saline solution | PAA Laboratories /Biochrom AG | L2045 | w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells |
| 8-Well chamber slides | BD Biosciences | 354108 | used for cell culture followed by microscopy |
| Cell culture flasks | Greiner BioOne | ||
| Cell culture media | Gibco (life technologies GmbH) | ||
| Fetal calf serum | Invitrogen | ||
| Poly-L-Lysine solution (0,01% – 50 ml) | Sigma | P4832 | used to coat cell culture chamber slides |
| Mountant Permafluor | ThermoScientific | S21022-3 | Mounting solution for microscopy |
| Hoechst-33258 | AppliChem | DNA stain for microscopy | |
| Hera-Safe | Heraeus Instruments | sterile work bench used for cell culture | |
| HERA cell | Heraeus Instruments | Incubator used for cell culture | |
| LSM510-Meta | Zeiss | used for confocal microscopy | |
| Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system | CRi, Woburn | used for whole body fluorescence imaging of small animals | |
| Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV) | GE Healthcare | used for measurement of absorption | |
| Spectrofluorometer (Jasco FP-6200) | Jasco | used for measurement of fluorescence emission | |
| Animals | |||
| NMRI mice (8-12 weeks old, male) | Elevage Janvier, France | used for inflammation trials | |
References
- Buse, J., El-Aneed, A. Properties, engineering and applications of lipid-based nanoparticle drug-delivery systems: current research and advances. Nanomedicine (Lond). 5, 1237-1260 (2010).
- Lim, S. B., Banerjee, A., Onyuksel, H. Improvement of drug safety by the use of lipid-based nanocarriers). Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 163, 34-45 (2012).
- Cabanes, A., et al. Enhancement of antitumor activity of polyethylene glycol-coated liposomal doxorubicin with soluble and liposomal interleukin 2. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 5, 687-693 (1999).
- Gabizon, A., Shmeeda, H., Grenader, T. Pharmacological basis of pegylated liposomal doxorubicin: impact on cancer therapy. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 45, 388-398 (2012).
- Balasubramanian, S. V., Bruenn, J., Straubinger, R. M. Liposomes as formulation excipients for protein pharmaceuticals: a model protein study. Pharmaceutical research. 17, 344-350 (2000).
- Meyer, J., Whitcomb, L., Collins, D. Efficient encapsulation of proteins within liposomes for slow release in vivo. Biochemical and biophysical research communications. 199, 433-438 (1994).
- Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et biophysica acta. 858, 161-168 (1986).
- Mayer, L. D., Bally, M. B., Hope, M. J., Cullis, P. R. Techniques for encapsulating bioactive agents into liposomes. Chemistry and physics of lipids. 40, 333-345 (1986).
- Walde, P., Ichikawa, S. Enzymes inside lipid vesicles: preparation, reactivity and applications. Biomolecular engineering. 18, 143-177 (2001).
- Weissleder, R., Ntziachristos, V. Shedding light onto live molecular targets. Nature medicine. 9, 123-128 (2003).
- Licha, K., Riefke, B., Ebert, B., Grotzinger, C. Cyanine dyes as contrast agents in biomedical optical imaging. Academic radiology. 9 Suppl 2, S320-S322 (2002).
- Pauli, J., et al. Novel fluorophores as building blocks for optical probes for in vivo near infrared fluorescence (NIRF) imaging. Journal of fluorescence. 20, 681-693 (2010).
- Holzer, W., et al. Photostability and thermal stability of indocyanine green. Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology. 47, 155-164 (1998).
- Gandorfer, A., Haritoglou, C., Kampik, A. Retinal damage from indocyanine green in experimental macular surgery. Investigative ophthalmology & visual science. 44, 316-323 (2003).
- Saxena, V., Sadoqi, M., Shao, J. Degradation kinetics of indocyanine green in aqueous solution. Journal of pharmaceutical. 92, 2090-2097 (2003).
- Kodjikian, L., et al. Toxic effects of indocyanine green, infracyanine green, and trypan blue on the human retinal pigmented epithelium. Graefe’s archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 243, 917-925 (2005).
- Sevick-Muraca, E. M., Houston, J. P., Gurfinkel, M. Fluorescence-enhanced, near infrared diagnostic imaging with contrast agents. Current opinion in chemical biology. 6, 642-650 (2002).
- Bremer, C., Ntziachristos, V., Weissleder, R. Optical-based molecular imaging: contrast agents and potential medical applications. European radiology. 13, 231-243 (2003).
- Hilderbrand, S. A., Kelly, K. A., Weissleder, R., Tung, C. H. Monofunctional near-infrared fluorochromes for imaging applications. Bioconjugate chemistry. 16, 1275-1281 (2005).
- Langhals, H., et al. Cyanine dyes as optical contrast agents for ophthalmological surgery. Journal of medicinal chemistry. 54, 3903-3925 (2011).
- Pauli, J., et al. An in vitro characterization study of new near infrared dyes for molecular imaging. European journal of medicinal chemistry. 44, 3496-3503 (2009).
- Ogawa, M., Kosaka, N., Choyke, P. L., Kobayashi, H. H-type dimer formation of fluorophores: a mechanism for activatable, in vivo optical molecular imaging. ACS chemical biology. 4, 535-546 (2009).
- Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 75, 4194-4198 (1978).
- Batzri, S., Korn, E. D. Single bilayer liposomes prepared without sonication. Biochimica et biophysica acta. 298, 1015-1019 (1973).
- Fahr, A., van Hoogevest, P., May, S., Bergstrand, N., ML, S. L. Transfer of lipophilic drugs between liposomal membranes and biological interfaces: consequences for drug delivery. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 26, 251-265 (2005).
- New, R. R. C. . Liposomes a practical approach. , (1990).
- Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16, 2806-2810 (1977).
- Schwendener, R. A. The preparation of large volumes of homogeneous, sterile liposomes containing various lipophilic cytostatic drugs by the use of a capillary dialyzer. Cancer drug delivery. 3, 123-129 (1986).
- Pauli, J., et al. Suitable labels for molecular imaging–influence of dye structure and hydrophilicity on the spectroscopic properties of IgG conjugates. Bioconjugate chemistry. 22, 1298-1308 (2011).
- Wu, P., Brand, L. Resonance energy transfer: methods and applications. Analytical biochemistry. 218, 1-13 (1994).
- Stark, B., Pabst, G., Prassl, R. Long-term stability of sterically stabilized liposomes by freezing and freeze-drying: Effects of cryoprotectants on structure. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 41, 546-555 (2010).
- Tansi, F. L., et al. Liposomal encapsulation of a near-infrared fluorophore enhances fluorescence quenching and reliable whole body optical imaging upon activation in vivo. Small. 9, 3659-3669 (2013).
- Chen, R. F., Knutson, J. R. Mechanism of fluorescence concentration quenching of carboxyfluorescein in liposomes: energy transfer to nonfluorescent dimers. Analytical biochemistry. 172, 61-77 (1988).
- Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility. BMC cell biology. 6, 14 (2005).
- Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Erdo, F., Torok, K., Aranyi, P., Szekely, J. I. A new assay for antiphlogistic activity: zymosan-induced mouse ear inflammation. Agents and actions. 39, 137-142 (1993).
- Ajuebor, M. N., et al. Endogenous monocyte chemoattractant protein-1 recruits monocytes in the zymosan peritonitis model. Journal of leukocyte biology. 63, 108-116 (1998).
- Ajuebor, M. N., Das, A. M., Virag, L., Szabo, C., Perretti, M. Regulation of macrophage inflammatory protein-1 alpha expression and function by endogenous interleukin-10 in a model of acute inflammation. Biochemical and biophysical research communications. 255, 279-282 (1999).
- Ajuebor, M. N., et al. Role of resident peritoneal macrophages and mast cells in chemokine production and neutrophil migration in acute inflammation: evidence for an inhibitory loop involving endogenous IL-10. J Immunol. 162, 1685-1691 (1999).
- Binstadt, B. A., et al. Particularities of the vasculature can promote the organ specificity of autoimmune attack. Nature. 7, 284-292 (2006).
- Ishida, T., Harashima, H., Kiwada, H. Liposome clearance. Bioscience reports. 22, 197-224 (2002).
- Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Understanding the correlation between in vitro and in vivo immunotoxicity tests for nanomedicines. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 172, 456-466 (2013).
- Szebeni, J., et al. Prevention of infusion reactions to PEGylated liposomal doxorubicin via tachyphylaxis induction by placebo vesicles: a porcine model. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 160, 382-387 (2012).
