Использование plusTipTracker Программное обеспечение для измерения микротрубочек Динамика в<em> Xenopus Хепориз</em> Шишки роста
Summary
MATLAB, открытой пакет программного обеспечения источник, plusTipTracker, может быть использована для анализа ряд изображений флуо- меченных + Советы для количественной динамики микротрубочек.
Abstract
Микротрубочек (МТ) плюс-конец-отслеживания белки (+ чаевые) локализуются в растущих плюс-концов МТ и регулировать MT динамику 1,2. Один из самых известных и широко-используемых + советов для анализа динамики MT является конец-связывающий белок, EB1, который связывает все растущие MT плюс-эндов, и, таким образом, является маркером MT полимеризации 1. Многие исследования поведения EB1 в роста конусов использовали времени и предвзятые с помощью компьютера, методы ручной слежения для анализа индивидуального МТС 1-3. Наш подход заключается в количественном глобальные параметры МТ динамики с использованием программного пакета, plusTipTracker 4, следующие приобретения высокого разрешения, живых образов меткой EB1 в культивируемых эмбриональных роста конусов 5. Это программное обеспечение является MATLAB основе, с открытым исходным кодом, удобный пакет, который сочетает в себе автоматическую обнаружения, сопровождения, визуализацию и анализ для фильмов флуоресцентно помечены + чаевые. Здесь мы представляем протокол для использования plusTipTRacker для анализа флуоресцентно меченных комет чаевые + в культивируемых Xenopus роста Хепориз конусов. Тем не менее, это программное обеспечение может также использоваться, чтобы характеризовать динамику МТ в различных типах клеток 6-8.
Introduction
Цель этого метода является получение количественной информации о микротрубочки (MT) плюс-конец-отслеживания белка (+ чаевые) динамику в живых конусы роста. MT + чаевые группа белков, которые локализуются в плюс-концов МТ 9,10. Они выполняют широкий спектр функций по регулированию параметров MT динамической неустойчивости 11, в том числе темпы полимеризации, катастрофы, и спасения. Одним из хорошо использовать метод анализа динамики МТ, чтобы отслеживать поведение наконечника EB1 +, который специфически связывается с растущей МТ плюс-концы 1,12. EB1 известно завербовать несколько других белков в растущей МТ плюс-концы 13,14, и недавно был создан как фактор MT созревания 15, содействия как рост МТ и катастроф частоту 15,16.
Многие исследования МТ динамики внутри роста конусов использовали методы ручной слежения для измерения изменений в динамике EB1-GFP с течением времени 1-3, как EB1 localizatiна МТ плюс-концы могут быть использованы в качестве маркера для полимеризации MT. Ключевым преимуществом для изучения EB1-GFP комет в качестве прокси для роста МТ является то, что MT динамика может быть измерена даже в регионах значительного MT перекрытия. В то время как метод ручной отслеживания EB1-GFP комет предоставил полезную информацию в МТ поведений 1-3, это отнимает много времени и может быть предвзятым. Кроме того, как аномальным ростом конусные поведения, скорее всего, результатом минутных сдвигов в цитоскелета динамики, анализа лишь небольшую группу МТС (обычно необходимо, когда рука-слежение) может пропустить важную информацию.
Таким образом, мы измеряем глобальные параметры динамики MT с помощью пакета программного обеспечения, plusTipTracker 4, после приобретения высокого разрешения, живых образов меткой EB1 в культивируемых эмбриональных роста конусов 5. Это программное обеспечение, разработан в Danuser Lab, был использован в ряде исследований, характеризующих MT динамику в различных типах клеток 6-8. Это с открытым исходным кодом, намэ с детьми, MATLAB на основе пакет, который включает в себя автоматизированное обнаружение, отслеживание, визуализацию и анализ для фильмов флуоресцентно помечены + чаевые. Длинный список конкретные параметры МТ динамики рассчитываются по этим программным обеспечением (см Reference 4 для деталей), но для анализа МТ динамики в конусы роста, наиболее полезные параметры MT скорость дорожки рост (в мкм / мин), трек рост жизни (в секундах), и длина трека рост (в микронах). Программное обеспечение можно загрузить непосредственно с сайта Danuser Lab (под "Software"). В то время как Danuser Лаборатория в настоящее время поддерживает более новый интерфейс для + анализа отслеживания TIP, который включен в пакет программного обеспечения под названием U-трека 2.0, оригинальная, автономные программное обеспечение будет оставаться доступны. Лежащие в основе алгоритмов между двумя программами одинаковы (по крайней мере, по состоянию на 2014 г.), только с разницей в интерфейсных и анализа результатов. Для начинающего пользователя с небольшим MATLAB и / или вычислительной анализа экспериментовENCE, plusTipTracker имеет больше удобных функций, в том числе автоматизированных выходов статистических параметров.
Здесь мы опишем шаги для анализа снимков динамики EB1-GFP в культивируемых Xenopus роста Хепориз конусов. Этот протокол был использован в недавней работе экзаменационной MT динамику 17. Смотрите также Лоури и соавт. 2012 5 Подробные инструкции относительно роста культивирование конусов, выражающих EB1-GFP. Хотя этот документ в первую очередь сосредоточены на изучении динамики EB1-GFP в роста конусов, тот же протокол может быть использован для других типов клеток 17. Для всех типов клеток, интервал времени между кадрами должна быть в пределах 0,5-2 сек для оптимального отслеживания + TIP. Временной интервал до 4 секунд между кадрами можно, но это увеличение интервала времени приводит к дополнительных ошибок трекинга.
Protocol
Representative Results
Discussion
PlusTipTracker предоставляет простой графический пользовательский интерфейс для быстрого и автоматического обнаружения практически все видимые EB1-GFP комет в клеточной или роста конуса, связать комет на дорожки, и рассчитывать параметры МТ. В других публикациях сообщается дизайн подобных ти…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Gaudenz Danuser and members of his lab for creating the plusTipTracker software and for helpful discussion regarding using the software, in particular Maria Bagonis and Sebastien Besson. We especially thank the Boston College Media Center for their assistance and support in the creation and editing of the video. We also thank members of the Lowery Lab for useful discussions and constructive criticism, and Abigail Antoine for proof-reading the manuscript. This work was funded by an NIH R00 MH095768 award to LAL.
Materials
| plusTipTracker software | Danuser Lab | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | This software may be hosted by another website in the future. If the listed site does not exist, search "Danuser Lab Software" on a web search engine to find the site. |
| Matlab software | Mathworks | http://www.mathworks.com/products/matlab/ |
References
- Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).
- Lee, H., et al. The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance. Neuron. , 913-926 (2004).
- Purro, S. A., et al. Wnt regulates axon behavior through changes in microtubule growth directionality: a new role for adenomatous polyposis coli. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 8644-8654 (2008).
- Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of structural biology. 176, 168-184 (2011).
- Lowery, L. A., Faris, A. E., Stout, A., Van Vactor, D. Neural Explant Cultures from Xenopus laevis. Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e4232 (2012).
- Long, J. B., et al. Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics. Molecular and cellular biology. 33, 1528-1545 (2013).
- Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis. The Journal of cell biology. 192, 321-334 (2011).
- Nishimura, Y., Applegate, K., Davidson, M. W., Danuser, G., Waterman, C. M. Automated screening of microtubule growth dynamics identifies MARK2 as a regulator of leading edge microtubules downstream of Rac1 in migrating cells. PLoS One. 7, e41413 (2012).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 309-322 (2008).
- Schuyler, S. C., Pellman, D. Microtubule ‘plus-end-tracking proteins’: The end is just the beginning. Cell. 105, 421-424 (2001).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312, 237-242 (1984).
- Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).
- Dixit, R., et al. Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).
- Li, W., et al. EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells. The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).
- Maurer, S. P., et al. EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics. Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).
- Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).
- Lowery, L. A., et al. Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth. Neural development. 8, 22 (2013).
- Marx, A., et al. Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules. Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).
