में microtubule गतिशीलता उपाय plusTipTracker सॉफ्टवेयर का उपयोग<em> Xenopus laevis</em> विकास शंकु
Summary
MATLAB आधारित, खुला स्रोत सॉफ्टवेयर पैकेज, plusTipTracker, microtubule गतिशीलता यों fluorescently लेबल + सुझावों की छवि श्रृंखला का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
Microtubule (मीट्रिक टन) से अधिक अंत ट्रैकिंग प्रोटीन (टिप्स) लाख टन की बढ़ती प्लस छोर तक स्थानीय बनाना और मीट्रिक टन गतिशीलता 1,2 विनियमित. मीट्रिक टन गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए सबसे अच्छी तरह से जाना जाता है और + व्यापक रूप से उपयोग किया सुझावों में से एक सब से बढ़ मीट्रिक टन से अधिक छोर बांध जो अंत बाध्यकारी प्रोटीन, EB1, है, और इस प्रकार, मीट्रिक टन polymerization 1 के लिए एक मार्कर है. विकास शंकु के भीतर EB1 व्यवहार के कई अध्ययनों से व्यक्तिगत लाख टन 1-3 विश्लेषण करने के लिए समय लेने वाली और पक्षपाती कंप्यूटर की मदद से, हाथ से ट्रैकिंग तरीकों का इस्तेमाल किया है. हमारा दृष्टिकोण उच्च संकल्प, सुसंस्कृत भ्रूण विकास शंकु 5 में चिह्नित EB1 का जीना छवियों के अधिग्रहण के बाद सॉफ्टवेयर पैकेज, plusTipTracker 4 का उपयोग मीट्रिक टन गतिशीलता के वैश्विक मानकों, जिसका अंदाजा है. इस सॉफ्टवेयर fluorescently लेबल + सुझावों की फिल्मों के लिए स्वचालित पहचान, ट्रैकिंग, दृश्य, और विश्लेषण को जोड़ती है कि एक MATLAB आधारित, खुला स्रोत, उपयोगकर्ता के अनुकूल पैकेज है. यहाँ, हम plusTipT प्रयोग करने के लिए प्रोटोकॉल पेशसुसंस्कृत Xenopus laevis विकास शंकु में fluorescently लेबल + टिप धूमकेतु के विश्लेषण के लिए racker. हालांकि, इस सॉफ्टवेयर को भी विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं 6-8 में मीट्रिक टन गतिशीलता चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
इस पद्धति का लक्ष्य मात्रात्मक microtubule (एमटी) के बारे में जानकारी के साथ साथ अंत ट्रैकिंग प्रोटीन (टिप) विकास शंकु रहने में गतिशीलता प्राप्त करने के लिए है. मीट्रिक टन + युक्तियाँ लाख टन 9,10 के प्लस छोर तक स्थानीयकरण कि प्रोटीन का एक समूह है. वे polymerization, तबाही, और बचाव की दरों सहित मीट्रिक टन गतिशील अस्थिरता 11, के मापदंडों को विनियमित करने के लिए कार्यों की एक श्रृंखला प्रदर्शन करते हैं. मीट्रिक टन गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए एक अच्छी तरह से इस्तेमाल किया विधि से बढ़ मीट्रिक टन करने के लिए विशेष रूप से बांध प्लस समाप्त होता 1,12 जो + टिप EB1 के व्यवहार को ट्रैक करने के लिए है. EB1 बढ़ रही मीट्रिक टन करने के लिए कई अन्य प्रोटीनों की भर्ती के लिए जाना जाता प्लस समाप्त होता मीट्रिक टन वृद्धि और तबाही आवृत्ति 15,16 दोनों को बढ़ावा देने, 13,14, और हाल ही में एक लाख टन परिपक्वता कारक 15 के रूप में स्थापित किया गया है.
विकास शंकु के भीतर मीट्रिक टन गतिशीलता के कई अध्ययनों EB1 localizati के रूप में, समय 1-3 से अधिक EB1-GFP गतिशीलता में परिवर्तन को मापने के लिए हाथ से ट्रैकिंग विधियों का उपयोग किया हैमीट्रिक टन करने पर अधिक सिरों मीट्रिक टन polymerization के लिए एक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. मीट्रिक टन के विकास के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में EB1-GFP धूमकेतु की जांच के लिए एक प्रमुख लाभ मीट्रिक टन गतिशीलता भी महत्वपूर्ण मीट्रिक टन ओवरलैप के क्षेत्रों में मापा जा सकता है. हाथ ट्रैकिंग EB1-GFP धूमकेतु की विधि मीट्रिक टन में उपयोगी अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है जबकि यह समय लेने वाली है और पक्षपाती किया जा सकता है, 1-3 व्यवहार. महत्वपूर्ण जानकारी याद कर सकते हैं इसके अतिरिक्त, न्यायपालिका विकास के रूप में कोन व्यवहार संभावना (हाथ से ट्रैकिंग जब आम तौर पर आवश्यक) लाख टन की ही एक छोटे सबसेट विश्लेषण cytoskeletal गतिशीलता में मिनट बदलाव का परिणाम हैं.
इस प्रकार, हम उच्च संकल्प, सुसंस्कृत भ्रूण विकास शंकु 5 में चिह्नित EB1 का जीना छवियों के अधिग्रहण के बाद, सॉफ्टवेयर पैकेज, plusTipTracker 4 का उपयोग वैश्विक मीट्रिक टन गतिशीलता मापदंडों को मापने. Danuser लैब में विकसित इस सॉफ्टवेयर, विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं 6-8 में मीट्रिक टन गतिशीलता निस्र्पक कई अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है. यह हमें एक खुला स्रोत हैएर के अनुकूल है, fluorescently लेबल + सुझावों की फिल्मों के लिए स्वचालित पहचान, ट्रैकिंग, दृश्य, और विश्लेषण भी शामिल है कि MATLAB आधारित पैकेज. मीट्रिक टन गतिशीलता के विशिष्ट मापदंडों इस सॉफ्टवेयर से गणना कर रहे हैं की एक लंबी सूची (विवरण के लिए संदर्भ 4 देखें), लेकिन विकास शंकु में मीट्रिक टन गतिशीलता के विश्लेषण के लिए, सबसे उपयोगी मानकों (माइक्रोन / मिनट में) मीट्रिक टन की वृद्धि ट्रैक वेग हैं, विकास ट्रैक (सेकंड में) जीवनकाल, और (माइक्रोन में) वृद्धि ट्रैक की लंबाई. सॉफ्टवेयर ("सॉफ्टवेयर" के तहत) Danuser लैब वेबसाइट से सीधे डाउनलोड किया जा सकता है. Danuser लैब वर्तमान में मूल, खड़े अकेले सॉफ्टवेयर उपलब्ध रहेगा एक सॉफ्टवेयर पैकेज बुलाया U-ट्रैक 2.0, में शामिल किया है जो + टिप ट्रैकिंग विश्लेषण, के लिए एक नया इंटरफेस का समर्थन करता है. दो कार्यक्रमों के बीच अंतर्निहित एल्गोरिदम इंटरफेस और विश्लेषण outputs के केवल एक अंतर के साथ, (कम से कम 2014 के रूप में) एक ही हैं. थोड़ा MATLAB और / या कम्प्यूटेशनल विश्लेषण अनुभव के साथ नौसिखिए उपयोगकर्ता के लिएखिलाडि़यों, plusTipTracker स्वचालित सांख्यिकीय पैरामीटर outputs सहित अधिक उपयोगकर्ता के अनुकूल सुविधाओं, है.
यहाँ, हम सुसंस्कृत Xenopus laevis विकास शंकु में EB1-GFP गतिशीलता की छवियों का विश्लेषण करने के लिए कदम का वर्णन. इस प्रोटोकॉल मीट्रिक टन गतिशीलता 17 की जांच हाल ही में एक समाचार पत्र में उपयोग किया गया था. भी Lowery एट अल देखें. 2012 5 EB1-GFP व्यक्त संवर्धन विकास शंकु के संबंध में विस्तृत निर्देश के लिए. इस पत्र में मुख्य रूप से विकास शंकु में EB1-GFP गतिशीलता की जांच पर ध्यान केंद्रित किया है, जबकि एक ही प्रोटोकॉल अन्य प्रकार की कोशिकाओं 17 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सभी प्रकार की कोशिकाओं के लिए, फ्रेम के बीच समय अंतराल इष्टतम + टिप ट्रैकिंग के लिए 0.5-2 सेकंड के बीच होना चाहिए. फ्रेम के बीच अप करने के लिए 4 सेकंड के एक समय अंतराल संभव है, लेकिन यह अतिरिक्त ट्रैकिंग त्रुटियों में अंतराल समय परिणामों में वृद्धि हुई.
Protocol
Representative Results
Discussion
PlusTipTracker जल्दी और स्वचालित रूप से, एक सेल या विकास शंकु में लगभग सभी दृश्य EB1-GFP धूमकेतु का पता लगाने पटरियों में धूमकेतु लिंक, और मीट्रिक टन मापदंडों की गणना करने के लिए एक सरल, ग्राफिकल यूजर इंटरफेस प्रदान क…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Gaudenz Danuser and members of his lab for creating the plusTipTracker software and for helpful discussion regarding using the software, in particular Maria Bagonis and Sebastien Besson. We especially thank the Boston College Media Center for their assistance and support in the creation and editing of the video. We also thank members of the Lowery Lab for useful discussions and constructive criticism, and Abigail Antoine for proof-reading the manuscript. This work was funded by an NIH R00 MH095768 award to LAL.
Materials
| plusTipTracker software | Danuser Lab | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | This software may be hosted by another website in the future. If the listed site does not exist, search "Danuser Lab Software" on a web search engine to find the site. |
| Matlab software | Mathworks | http://www.mathworks.com/products/matlab/ |
References
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