Använda plusTipTracker Programvara för att mäta mikrotubuli Dynamics in<em> Xenopus laevis</em> Tillväxt Kottar
Summary
MATLAB-baserade, open source programpaket, plusTipTracker, kan användas för att analysera bild serie fluorescensmärkta + tips för att kvantifiera mikrotubuli dynamik.
Abstract
Mikrotubuli (MT) plus-end-tracking proteiner (+ tips) lokalisera de växande plus-ändarna av MT och reglera MT dynamik 1,2. En av de mest kända och allmänt utnyttjade + tips för att analysera MT dynamik är slut bindande protein, EB1, som binder alla växande MT plus-ändar, och därmed är en markör för MT polymerisation 1. Många studier av EB1 beteende inom tillväxt kottar har använt tidskrävande och fördomsfulla datorstödda, handspårningsmetoder för att analysera enskilda MTs 1-3. Vår inställning är att kvantifiera globala parametrar för MT dynamik med hjälp av programpaketet, plusTipTracker 4, efter förvärvet av högupplösta, levande bilder av taggade EB1 i odlade embryonala tillväxtkoner 5. Denna programvara är en MATLAB-baserad, öppen källkod, användarvänligt paket som kombinerar automatiserad upptäckt, spårning, visualisering och analys för filmer av fluorescensmärkta + tips. Här presenterar vi protokollet för att använda plusTipTracker för analys av fluorescensmärkta + tips kometer i odlade Xenopus laevis tillväxt kottar. Dock kan denna programvara också användas för att karaktärisera MT dynamiken i olika celltyper 6-8.
Introduction
Målet med denna metod är att få kvantitativ information om mikrotubuli (MT) plus-end-tracking protein (+ TIP) dynamik i levande tillväxt kottar. MT + Tips är en grupp av proteiner som lokaliserar till plus-ändar MTs 9,10. De utför en rad funktioner för att reglera parametrar för MT dynamisk instabilitet 11, däribland andelen polymerisation, katastrof, och räddning. En väl använd metod för analys av MT dynamik är att spåra beteende + TIP EB1, som binder specifikt till växande MT plus slutar 1,12. EB1 är känd för att rekrytera flera andra proteiner att växa MT plus slutar 13,14, och har nyligen etablerats som en MT mognadsfaktor 15, främja både MT tillväxt och katastroffrekvensen 15,16.
Många studier av MT dynamiken i tillväxt kottar har använt handspårningsmetoder för att mäta förändringar i EB1-GFP dynamik över tiden 1-3, som EB1 localizatitill MT plus gränder kan användas som markör för MT polymerisation. En viktig fördel för att pröva EB1-GFP kometer som en proxy för MT tillväxt är att MT dynamik kan mätas även i regioner med betydande MT överlappning. Även metoden för hand tracking EB1-GFP kometer har gett nyttiga insikter MT beteenden 1-3, det är tidskrävande och kan vara partisk. Dessutom så avvikande tillväxt kon beteenden är troligen ett resultat av små förskjutningar i cytoskelettala dynamik, analysera endast en liten delmängd av MT (oftast nödvändigt när hand tracking) kan missa viktig information.
Därför mäter vi globala MT dynamik parametrar med programpaketet plusTipTracker 4, efter förvärvet av högupplösta, levande bilder av taggade EB1 i odlade embryonala tillväxtkoner 5. Denna programvara, som utvecklats i Danuser Lab, har använts i flera studier som kännetecknar MT dynamiken i olika celltyper 6-8. Det är en öppen källkod, osser med barn, MATLAB-baserade paket som inkluderar automatisk detektering, spårning, visualisering och analys för filmer av fluorescensmärkta + tips. En lång lista med specifika parametrar för MT dynamik beräknas av denna programvara (se referens 4 för detaljer), men för analys av MT dynamiken i tillväxt kottar, de mest användbara parametrarna är MT tillväxtspåret hastigheten (i mikrometer / minut), tillväxtspåret livslängd (i sekunder), och tillväxt banlängd (i mikrometer). Programvaran kan laddas ner direkt från Danuser Lab webbplats (under "Programvara"). Medan Danuser Lab stödjer för närvarande en nyare gränssnitt för + TIP spårning analys, som är införlivat ett programpaket som kallas u-spår 2,0, originalet, fristående programvara förblir tillgängliga. De underliggande algoritmerna mellan de två programmen är samma (åtminstone från och med 2014), med bara en skillnad på gränssnitt och analys utgångar. För nybörjare med lite MATLAB och / eller beräkningsanalys experihet har plusTipTracker mer användarvänliga funktioner, inklusive automatiserade statistiska parameter utgångar.
Här beskriver vi följande steg för att analysera bilder av EB1-GFP dynamiken i odlade Xenopus laevis tillväxtkoner. Detta protokoll användes nyligen i en pappers undersöker MT dynamik 17. Se även Lowery et al. 2012 5 för detaljerade instruktioner om odling tillväxt kottar uttrycker EB1-GFP. Även denna uppsats främst inriktad på att undersöka EB1-GFP dynamiken i tillväxt kottar, kan samma protokoll användas för andra celltyper 17. För alla celltyper, bör tidsintervallet mellan bilderna vara mellan 0,5-2 sek för optimal + TIP spårning. Ett tidsintervall på upp till 4 sekunder mellan ramar är möjligt, men denna ökade intervalltid ger ytterligare spårningsfel.
Protocol
Representative Results
Discussion
PlusTipTracker ger ett enkelt, grafiskt användargränssnitt för att snabbt och automatiskt upptäcka praktiskt taget alla synliga EB1-GFP kometer i en cell eller tillväxt kon, länka kometer i spår, och beräkna MT parametrar. Andra publikationer har rapporterat konstruktionen av liknande typer av mjukvara (t.ex. Marx et al. Utnyttjas också kvantitativ analys av etikette EB1 dynamik i tillväxtkoner 18). Men verkar detta program att vara unik i sin lättillgänglighet, eftersom det är fritt ned…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Gaudenz Danuser and members of his lab for creating the plusTipTracker software and for helpful discussion regarding using the software, in particular Maria Bagonis and Sebastien Besson. We especially thank the Boston College Media Center for their assistance and support in the creation and editing of the video. We also thank members of the Lowery Lab for useful discussions and constructive criticism, and Abigail Antoine for proof-reading the manuscript. This work was funded by an NIH R00 MH095768 award to LAL.
Materials
| plusTipTracker software | Danuser Lab | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | This software may be hosted by another website in the future. If the listed site does not exist, search "Danuser Lab Software" on a web search engine to find the site. |
| Matlab software | Mathworks | http://www.mathworks.com/products/matlab/ |
References
- Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).
- Lee, H., et al. The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance. Neuron. , 913-926 (2004).
- Purro, S. A., et al. Wnt regulates axon behavior through changes in microtubule growth directionality: a new role for adenomatous polyposis coli. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 8644-8654 (2008).
- Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of structural biology. 176, 168-184 (2011).
- Lowery, L. A., Faris, A. E., Stout, A., Van Vactor, D. Neural Explant Cultures from Xenopus laevis. Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e4232 (2012).
- Long, J. B., et al. Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics. Molecular and cellular biology. 33, 1528-1545 (2013).
- Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis. The Journal of cell biology. 192, 321-334 (2011).
- Nishimura, Y., Applegate, K., Davidson, M. W., Danuser, G., Waterman, C. M. Automated screening of microtubule growth dynamics identifies MARK2 as a regulator of leading edge microtubules downstream of Rac1 in migrating cells. PLoS One. 7, e41413 (2012).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 309-322 (2008).
- Schuyler, S. C., Pellman, D. Microtubule ‘plus-end-tracking proteins’: The end is just the beginning. Cell. 105, 421-424 (2001).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312, 237-242 (1984).
- Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).
- Dixit, R., et al. Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).
- Li, W., et al. EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells. The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).
- Maurer, S. P., et al. EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics. Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).
- Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).
- Lowery, L. A., et al. Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth. Neural development. 8, 22 (2013).
- Marx, A., et al. Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules. Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).
