Snelle en robuuste analyse van Cellulaire en Moleculaire Polarisatie geïnduceerd door Chemokine Signaling
Summary
Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.
Abstract
Cellen reageren op stimulatie door chemokine verliezen hun ronde vorm in een proces genaamd polarisatie, en door het veranderen van de subcellulaire lokalisatie van verschillende proteïnen. Klassieke beeldvormende technieken gebruikt om deze fenomenen. Echter, vereist zij de handmatige overname van vele cellen, gevolgd door tijdrovende kwantificering van de morfologie en de co-localisatie van de kleuring van tientallen cellen. Hier is een snelle en krachtige methode beschreven om deze fenomenen te bestuderen monsters uit meerdere duizenden cellen met een beeldvormende flowcytometrie technologie die de voordelen van een microscoop met die van een cytometer combineert. Met T-lymfocyten gestimuleerd met CCL19 en kleuring voor MHC klasse I moleculen en filamenteuze actine, wordt een gating gepresenteerde gelijktijdig meten van de mate van veranderingen vorm en de mate van co-lokalisatie van markers die worden beïnvloed door CCL19 signalering. Bovendien is deze gating strategie liet ons toe om OBSERVe de segregatie van draadvormige actine (aan de voorzijde) en gefosforyleerd Ezrin-Radixin-Moesin (fosfo-ERM) eiwitten (aan de achterkant) in gepolariseerd T-cellen na CXCL12 stimulatie. Deze techniek was ook nuttig om de blokkerende effect op de polarisatie van twee verschillende elementen waarnemen: remming van actine polymerisatie door een farmacologische remmer en expressie van mutanten van de Par6 / atypische PKC signaleringsroute. Aldus wordt bewijs blijkt dat deze techniek nuttig is voor zowel morfologische veranderingen en eiwit herverdeling analyseren.
Introduction
Chemokines zijn kleine oplosbare eiwitten die cellen aan te trekken om gespecialiseerde locaties 1. Daarom zij deelnemen aan de juiste positionering van de cellen in weefsels, een cruciale functie in de ontwikkeling en fysiologie. Het immuunsysteem is geen uitzondering op deze regel als het gebaseerd is op de actie van vele verschillende celtypen die in onderling overleg handelen om een effectieve immuunrespons. Door het regelen van de specifieke locatie van een immuun celtype in een bepaalde toestand, chemokinen vooraf vereist voordat vreemde antigenen kunnen worden gedetecteerd en geneutraliseerd.
In T-lymfocyten in het bijzonder, chemokines binden aan specifieke oppervlak receptoren die, de huisbediende ontlokken vele intracellulaire signalen (calcium stijging, ERK fosforylering, Rho GTPasen activering, toename van integrines affiniteit en cytoskelet wijzigingen) dat T-cel beweeglijkheid 2,3 bevoordelen. Op cellulair niveau, kan men morfologische wijzigingen geïnduceerd op chemokine stimulatie observeren.Deze veranderingen in cel vormen zijn bijzonder dramatisch in T-cellen: rustende T cellen een druppelvormig ronde morfologie reizen binnen de bloedstroom. De detectie van de aanwezigheid van chemokinen in ontstekingsplaatsen of nabijheid van lymfoïde organen zal de vorm van T-cellen die nu vast een typische "hand-mirror" morfologie bestaande uit een bipolaire vorm veranderen: een leidende rand aan de voorzijde en een achterste rand, of Uropode, aan de achterkant 4. Daarnaast kunnen intracellulaire componenten gescheiden in de twee tegenoverliggende gebieden van een gepolariseerde T-cel migratie ondersteunen. Bijvoorbeeld, actine filamenten polymerisatie stijgt op chemokine stimulatie 5 en gepolymeriseerd actine accumuleert aan de voorzijde van een gepolariseerde T-cel 2. Anderzijds, verscheidene eiwitten, zoals gefosforyleerde eiwitten van de Ezrin-Radixin-Moesin (ERM) familie die het plasmamembraan koppelen aan de corticale F-actine cytoskelet, opnieuw lokaliseren de Uropode gepolariseerdeT-cellen 6. Interessant wij en anderen hebben aangetoond dat dit polarisatieproces vereist voor T celmigratie. Inderdaad, zal er geen behandeling die interfereert met polarisatie cellulaire beweeglijkheid remmen. Bijvoorbeeld, remming van de activiteit van de leden van de atypische eiwitkinasen C (PKC) families, PKCζ en PKCι blokken T cel polarisatie en hun trekkende scannen van dendritische cellen 7. T-cel polarisatie wordt ook geregeld door Rho GTPasen. We hebben aangetoond dat de modulatie van RhoA activiteit van de recent beschreven Fam65b eiwit interfereert met T cel veranderingen in morfologie en hun vermogen om te migreren in Transwell assay 6. Als polarisatie voorwaarde stap voor cellulaire motiliteit, is dus cruciaal te kunnen kwantificeren als belangrijkste uitlezen van chemokine reacties. Cel vorm verbouwingen waren eerder handmatig 8 gemeten. Echter, dergelijke kwantificering is zeer tijdrovend, waardoor gewoonlijk slechts enkeletientallen cellen rekening gehouden.
Hier wordt een nieuwe methode voorgesteld om snel kwantificeren van de mate van veranderingen vorm van T-lymfocyten blootgesteld aan stimulatie chemokine. Een imaging flowcytometrie technologie (zie tabel specifieke reagentia / Apparatuur) gebruikt, die de voordelen van een stromingscytometer en een microscoop 9 combineert efficiënt kwantificeren van de hoeveelheid gepolariseerde cellen onder verschillende condities van chemokine stimulatie. Naast de kwantificering van de morfologische veranderingen die robuust kan meten met deze techniek, is het ook mogelijk om veranderingen in de subcellulaire lokalisatie van sommige eiwitten op chemokine signalering evalueren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een recente techniek van beeldvorming flowcytometrie, een snelle en informatieve gating strategie analyseren cellulaire en moleculaire gebeurtenissen geïnduceerd door chemokine stimulatie wordt gepresenteerd. De veranderingen in celmorfologie geïnduceerd door chemokine stimulatie en de subcellulaire verdeling van verschillende eiwitten tijdens het polarisatieproces: Uit één experiment kan men twee soorten informatie. Interessant is bewijs ook voorzien in de mogelijkheid om een groot aantal cellen, die statisti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs sterk erkennen Pierre Bourdoncle, Thomas Guilbert en Louise Rimbault van de Cochin Imaging Facility. Dit werk werd ondersteund door Inserm, CNRS en de Ligue Nationale contre le Cancer (Equipe Labellisée).
Materials
| Name of the material/Equipment | Company | Catalog number | Comments/Description (optional) |
| RPMI | Gibco | 61870-010 | |
| Human serum AB | PAA | C11-021 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Fetal calf serum | PAN Biotech | P30-3300 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Human T cell nucleofactor kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Murine IL7 | Peprotech | 217-17 | |
| HBSS | Gibco | 14025-050 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Hepes | Gibco | 15630-056 | |
| Murine CCL19 | Peprotech | 250-27B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CCL19 | Peprotech | 300-29B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CXCL12 | Peprotech | 300-28A | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells. |
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 157-8-100 | This is a 8 % PFA solution in water. Mix volume to volume with 2X PBS to obtain a 4 % PFA solution in PBS. |
| BSA | Sigma | A3059 | |
| Saponin | Fluka | 84510 | |
| Alexa Fluor 594 phalloidin | Invitrogen | A12381 | |
| FITC-anti-HLA-ABC antibody | Beckman Coulter | IM1838 | clone B9.12.1 |
| Anti-P-ERM antibody | Cell Signaling Technology | 3149P | |
| ImageStreamx Mark II | Amnis |
References
- Rossi, D., Zlotnik, A. The biology of chemokines and their receptors. Annu Rev Immunol. 18, 217-242 (2000).
- Thelen, M., Stein, J. V. How chemokines invite leukocytes to dance. Nat Immunol. 9 (9), 953-959 (2008).
- Rougerie, P., Rho Delon, J. GTPases: masters of T lymphocyte migration and activation. Immunol Lett. 142 (1-2), 1-13 (2012).
- Sanchez-Madrid, F., del Pozo, M. A. Leukocyte polarization in cell migration and immune interactions. Embo J. 18 (3), 501-511 (1999).
- Adams, D. H., et al. Hepatocyte growth factor and macrophage inflammatory protein 1 beta: structurally distinct cytokines that induce rapid cytoskeletal changes and subset-preferential migration in T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (15), 7144-7148 (1994).
- Rougerie, P., et al. Fam65b is a new transcriptional target of FOXO1 that regulates RhoA signaling for T lymphocyte migration. J Immunol. 190 (2), 748-7455 (2013).
- Real, E., Faure, S., Donnadieu, E., Delon, J. Cutting edge: Atypical PKCs regulate T lymphocyte polarity and scanning behavior. J Immunol. 179 (9), 5649-5652 (2007).
- Negulescu, P. A., Krasieva, T. B., Khan, A., Kerschbaum, H. H., Cahalan, M. D. Polarity of T cell shape, motility, and sensitivity to antigen. Immunity. 4 (5), 421-430 (1996).
- Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. The ImageStream System: a key step to a new era in imaging. Folia Histochem Cytobiol. 45 (4), 279-290 (2007).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), 409 (2007).
- James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers. J Vis Exp. (25), (2009).
- Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
- Freeley, M., et al. L-plastin regulates polarization and migration in chemokine-stimulated human T lymphocytes. J Immunol. 188 (12), 6357-6370 (2012).
