Snabb och Robust analys av cellulär och molekylär Polarisering inducerad av Chemokine Signa

Summary

Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.

Abstract

Celler svarar på chemokin stimulering genom att förlora sin runda form i en process som kallas polarisering, och genom att ändra subcellulära lokalisering av många proteiner. Klassiska avbildningstekniker har använts för att studera dessa fenomen. Dock krävs det manuell förvärv av många celler följt av tidskrävande kvantifiering av morfologin och samlokalisering av färgning av tiotals celler. Här är en snabb och kraftfull metod som beskrivs för att studera dessa fenomen på prover som består av flera tusen celler med hjälp av en bild flödescytometri teknik som kombinerar fördelarna med ett mikroskop med de av en cytometer. Använda T-lymfocyter stimulerade med CCL19 och färgning för MHC klass I-molekyler och fintrådiga aktin, är en grindstrategi som presenteras för mätning samtidigt graden av formförändringar och omfattningen av samlokalisering av markörer som påverkas av CCL19 signalering. Dessutom har denna gating strategi tillät oss att Observe segregeringen av fintrådiga aktin (längst fram) och fosforyleras Ezrin-radixin-moesin (fosfor-ERM) proteiner (baktill) i polarise T-celler efter CXCL12 stimulering. Denna teknik var också nyttigt att observera den blockerande effekt på polarisering av två olika delar: hämning av aktin polymerisation av en farmakologisk hämmare och uttryck av mutanter av Par6 / atypiska PKC signaleringsvägen. Således är bevis visat att denna teknik är användbar för att analysera båda morfologiska förändringar och protein omfördelningar.

Introduction

Kemokiner är små lösliga proteiner som lockar celler till specialiserade platser ^1. Därför deltar de i rätt placering av celler i vävnader, en avgörande funktion i utvecklingen och fysiologi. Immunförsvaret är inget undantag från denna regel eftersom det bygger på effekten av många olika celltyper som samverkar om att montera ett effektivt immunsvar. Genom att kontrollera den specifika platsen av en immuncelltypen i ett givet tillstånd, kemokiner är pre-krävs innan främmande antigener kan detekteras och neutraliseras.

I T-lymfocyter i synnerhet, kemokiner binder till specifika ytreceptorer som, vid ingrepp, framkallar många intracellulära signaler (kalcium rise, ERK fosforylering, Rho GTPaser aktiverings, ökning av integriner affinitet och cytoskelettala förändringar) som gynnar T cellmotilitet ^2,3. På cellnivå, kan man observera morfologiska förändringar framkallade vid chemokin stimulering.Dessa förändringar i cellformer är särskilt dramatisk i T-celler: vilande T-celler har en pärlliknande rund morfologi när de reser i blodet. Dock är avkänning av förekomsten av kemokiner i inflammatoriska ställen eller vid närhet lymfoidorgan kommer att ändra formen på T-celler som nu antar en typisk "handspegel" morfologi bestående av en bipolär formen: en framkant på framsidan och en bakkant, eller uropod, på baksidan ^4. Dessutom kan intracellulära komponenter segregerar in i dessa två motsatta områden av en polariserad T-cell för att upprätthålla migrering. Exempelvis aktinfilament polymerisationsförfaranden ökar vid kemokin stimulering ⁵ och polymeriserad aktin ackumuleras på framsidan av en polariserad T-cell ^2. Å andra sidan, flera proteiner, såsom fosforylerade proteiner hos Ezrin-radixin-moesin (ERM) -familjen som kopplar plasmamembranet till det kortikala F-aktin cytoskelettet, åter lokalisera vid uropod av polariseradT-celler ^6. Intressant nog har vi och andra visat att denna polarisering process krävs för T-cell migration. I själva verket kommer någon behandling som stör polarisering hämma cellulär motilitet. Till exempel, hämning av aktiviteten av medlemmarna i den atypiska proteinkinaser C (PKC) familj, PKCζ och PKCι blockerar T-cell polarisering och deras vandrande skann av dendritiska celler ^7. T-cell polarisering regleras också av Rho GTPaser. Vi har visat att moduleringen av RhoA aktivitet genom den nyligen beskrivna Fam65b protein stör T-cellförändringar i morfologi och deras förmåga att migrera i en Transwell-analys ^6. Som polarisering är en förutsättning steg för cellulär motilitet är det alltså viktigt att kunna kvantifiera det som en huvud avläsning av kemokina svar. Cell form förändringar tidigare uppmätta manuellt ^8. Emellertid är denna typ av kvantifiering mycket tidskrävande, så att vanligen endast ett fåtaltiotals celler beaktas.

Här används en ny metod presenteras för att snabbt kvantifiera graden av form förändringar av T-lymfocyter exponerade för kemokin stimulering. En bild flödescytometri teknik (se tabell av särskilda reagenser / Utrustning) används, vilket kombinerar fördelarna med en flödescytometer och ett mikroskop ⁹ att kvantifiera effektivt mängden polarise celler i olika förhållanden kemokin stimulering. Förutom kvantifiering av de morfologiska förändringar som man kan mäta kraftigt med denna teknik är det också möjligt att utvärdera förändringar i subcellulära lokalisering av vissa proteiner vid chemokin signalering.

Protocol

1. Framställning av T-lymfocyter Förbered primär mus eller humana T-celler, såsom beskrivits 10,11. Odla humana T-celler i komplett RPMI-medium med 10% humant serum AB vid en densitet av 2-3 x 10 6 celler / ml. OBS: Användning av fetalt kalvserum (FCS) i stället för humant serum kan framkalla spontan polarisation av en stor fraktion av humana T-celler i odling. Förvara dessa celler i odling under 4-5 dagar och ytterligare process dem när som helst under denna pe…

Representative Results

Det första exemplet väljs här gäller användningen av mänskliga primära T-lymfocyter som stimulerats med CCL19. Emellertid kan samma strategi användas med primär mus-T-celler, T-cellinjer eller någon annan celltyp som reagerar för kemokin stimulering. Strategin gating presenteras här innehåller en rad fönster som väljer de fokuserade händelser, då de enskilda cellerna. Slutligen intervallet fluorescensintensitet följes här som ett exempel på två markörer: MHC klass I HLA-ABC och filamentös aktin f?…

Discussion

Med hjälp av en ny teknik för bild flödescytometri, en snabb och informativ gating strategi för att analysera cellulära och molekylära händelser som framkallas av kemokin stimulering presenteras. Från ett enda experiment, kan man få två huvudtyper av information: förändringar i cellmorfologi inducerade av kemokin stimulering och subcellulära fördelningen av olika proteiner under polariseringsprocessen. Intressant är bevis också för möjligheten att analysera ett stort antal celler, vilket möjliggör st…

Materials

Name of the material/Equipment	Company	Catalog number	Comments/Description (optional)
RPMI	Gibco	61870-010
Human serum AB	PAA	C11-021	Pre-heat to inactivate the complement.
Fetal calf serum	PAN Biotech	P30-3300	Pre-heat to inactivate the complement.
Human T cell nucleofactor kit	Lonza	VCA-1002
Murine IL7	Peprotech	217-17
HBSS	Gibco	14025-050	Warm in 37 °C water bath before use.
Hepes	Gibco	15630-056
Murine CCL19	Peprotech	250-27B	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.
Human CCL19	Peprotech	300-29B	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.
Human CXCL12	Peprotech	300-28A	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells.
PFA	Electron Microscopy Sciences	157-8-100	This is a 8 % PFA solution in water. Mix volume to volume with 2X PBS to obtain a 4 % PFA solution in PBS.
BSA	Sigma	A3059
Saponin	Fluka	84510
Alexa Fluor 594 phalloidin	Invitrogen	A12381
FITC-anti-HLA-ABC antibody	Beckman Coulter	IM1838	clone B9.12.1
Anti-P-ERM antibody	Cell Signaling Technology	3149P
ImageStreamx Mark II	Amnis