Regioselectiva biolística Focalización en Organotípicos cerebro rebanadas Usando una pistola de genes Modificado

Summary

Recent improvements in organotypic brain slice preparations have permitted their exploitation for biotechnological applications. Organotypic slices maintain local structural characteristics of in vivo biology, including functional synaptic connections. Here we present a regioselective biolistic delivery method to label and genetically manipulate these slices.

Abstract

La transfección de ADN ha sido de gran valor para las ciencias biológicas y con los últimos avances en preparaciones de cortes de cerebro organotípicos, el efecto de varios genes heterólogos por lo tanto podría ser investigado fácilmente manteniendo muchos aspectos de la biología in vivo. Ha habido un interés creciente para transfectar neuronas terminales diferenciadas para las que los métodos de transfección convencionales han estado plagado de dificultades, tales como los bajos rendimientos y pérdidas significativas en la viabilidad. Transfección biolística puede eludir muchas de estas dificultades sin embargo, sólo recientemente se ha modificado esta técnica de modo que es susceptible para su uso en tejidos de mamíferos.

Nuevas modificaciones a la cámara de acelerador han mejorado la precisión de disparo de la pistola de genes y el aumento de sus profundidades de penetración mientras que también permite el uso de presión de gas inferior (50 psi) sin pérdida de eficiencia de la transfección así como permitir un margen regioselectiva enfocada del paARTÍCULOS para dentro de 3 mm. Además, esta técnica es sencillo y rápido de realizar que microinyecciones tediosas. Tanto expresión transitoria y estable son posibles con nanopartículas bombardeo donde la expresión episomal puede ser detectado dentro de 24 horas y la supervivencia de las células ha demostrado ser mejor que, o al menos igual a, métodos convencionales. Esta técnica tiene sin embargo una ventaja crucial: permite la transfección a ser localizados dentro de un solo radio restringido permitiendo así al usuario aislar anatómicamente efectos del gen heterólogo. Aquí presentamos un protocolo detallado para preparar adultos viable rebanadas organotípicos y someterlos a regioselectiva transfección utilizando una pistola de genes mejorada.

Introduction

Originalmente la técnica biolistic, una frase a su vez-de-para "balística biológicos", se estableció para la transferencia génica mediada por partículas en las células vegetales ^1. Este método físico de la transformación celular micro o nanopartículas acelera a alta velocidad para superar las barreras físicas de las membranas impermeables a las células con el fin de entregar cargamentos tales como ADN o colorantes. Debido a que no depende de ligando de receptores específicos y / o las propiedades bioquímicas en las membranas de la superficie celular, transferencia de genes mediada por partículas se puede aplicar fácilmente a una variedad de sistemas biológicos, tales como cortes de cerebro organotípicos.

Usando rebanadas organotípicos tienen ventajas sobre otros en las plataformas in vitro ya que mantienen muchas de las propiedades anatómicas y bioquímicas que son pertinentes a la biología in vivo ^2-4. Las rebanadas mayoría conservan las características arquitectónicas locales desde donde se han originado y preserve la actividad neuroquímica y la conectividad de las sinapsis. El uso de cortes de cerebro para la investigación básica, y en los esfuerzos farmacéuticos, ha aumentado de forma concomitante con el número de posibles manipulaciones biotecnológicas para medir y monitorear los comportamientos neurobiológicas del cerebro en un in vivo como contexto ^3,5-7. Las principales ventajas para el uso de sistemas de ensayo a base de cortes organotípicos es que proporciona control experimental fácil y permite manipulaciones precisas de ambientes extracelulares.

Fructíferamente, sistemas de cultivo de cortes organotípicos se han establecido a partir de una variedad de regiones cerebrales, tales como, pero no limitado a, la corteza, la médula espinal y cerebelo ^8-10. Además, un número de cocultivos se ha demostrado, que permiten la evaluación de la comunicación intercelular entre las regiones cerebrales distales así como entre las neuronas y las células patológicas ^11,12. Muchos protocolos ya han sido establecidos para successfully rebanadas cultura organotípicos y puede mantener la viabilidad a largo plazo y muchos estudios recientes ahora utilizan los métodos de interfaz de membrana y varias modificaciones a la misma ^13. Este principio mantiene las rebanadas organotípicos en la interfaz entre el medio y la atmósfera humidificada de la incubadora colocando las rodajas en un filtro de membrana porosa. El medio puede así proporcionar suficientes nutrientes para alimentar a las rebanadas organotípicos mediante movimiento capilar. Típicamente rebanadas se han preparado a partir de animales postnatales tempranos (3 – 9 días de edad; P3 – 9). Sin embargo, los tejidos del cerebro de estas rebanadas mostrar un alto nivel de plasticidad celular y tienen una resistencia inherente a los esfuerzos mecánicos, que es útil para obtener cultivos viables, sin embargo, las sinapsis maduras y circuitos neuroanatómico no se han desarrollado completamente in vivo hasta 2 a 3 semanas de edad ^14. Por ejemplo, las observaciones anteriores habían demostrado que los cortes de hipocampo obtenidas de P0 – 1 neonatos, aunque muy viable siguiente preparación, perdiendo algunas características morfológicas. Esencialmente, ellos demostraron ser inadecuados para cultivos a largo plazo sugieren células inmaduras fueron más propensos a des-diferenciar en comparación con cultivos organotípicos de animales mayores ^15,16. Por esta razón, nuestro método ha sido optimizado para los cortes de cerebro organotípicos adultos en la que la maduración y el desarrollo arquitectónico han llegado a sus etapas terminales ^13,17-21. Sin embargo, este método también es adecuado para el recién nacido y rebanadas organotípicos juveniles.

Una vez que se han producido las rebanadas organotípicos viables toda la placa que contiene las rebanadas puede ser llevado al monte biolistic y sometido a regioselectiva entrega y transfección. El montaje correcto de la pistola de genes (como se describe en la Figura 1), orientado 90 ° a una distancia de 10 mm directamente sobre las rebanadas (desde la abertura en el tejido), permite el rápido suministro biolístico de los 40 nm irld partículas recubierto cargas. Estas cargas tales como tintes y vectores de ADN fluorescentes, así como cualquier gen de interés, se entregan fácilmente en las rodajas viables con facilidad. Así pues, este método describe el protocolo necesario para ofrecer, de una manera regioselectiva, carga recubierto las nanopartículas de oro en cortes de cerebro organotípicos viables. El cañón de la pistola de genes y montaje óptimo se puede ver en la Figura 1. Para más información sobre las mejores balística barril y nanopartículas, por favor ver O'Brien, et al., ^17.

Refinamientos posteriores también están indicados para el usuario para optimizar las condiciones tales como la cantidad apropiada de oro entregado por área objetivo, definida como microportadores Cantidad de carga (MLQ), y para determinar la cantidad de ADN cargado por mg de oro, definido como de relación de ADN Cargando (DLR). Antes de la precipitación de ADN en partículas de oro y cargarlos en el tubo Tefzel que comprende cartuchos de la pistola de genes real '9 ;, es necesario para calcular la cantidad de ADN y el oro requerida para cada transfección que puede diferir ligeramente entre los tejidos y las condiciones (relación debe mantenerse entre 1 mg de oro y 1 g de ADN a 1: 5). Es vital para preparar la proporción adecuada de MLQ a DLR en contrario partículas de oro recubiertas de ADN podrían adherirse entre sí formando más grande que la aglomeración se esperaba, lo que podría reducir la homogeneidad global de la propagación biolistic así como daños incremento del tejido y la citotoxicidad.

Este método muestra las recientes mejoras en el suministro biolístico, que han sido probados y decididos a ser susceptibles de cortes de cerebro organotípicos neonatales, juveniles y adultos. Además, mediante la explotación de propagación reducida biolístico el gen arma de barril, el usuario es ahora capaz de transfectar de forma selectiva una región puntual en el cerebro. Tras el tiempo de incubación apropiado, la expresión de las proteínas fluorescentes, que alcanza sus tasas máximas entre 24 y 48hr, se puede visualizar mediante epifluorescencia y microscopía confocal. Estos fluoróforos permiten el análisis morfológico y la localización de las células individuales dentro de las estructuras biológicamente relevantes. Sin embargo, la modulación regioselectiva de las rebanadas organotípicos por otros genes heterólogos también puede ser controlado por cualquier otra prueba susceptibles de estas preparaciones. Posibles estrategias de trabajo para la entrega de genes localizados se presentan en la Figura 2.

Protocol

El uso de animales y tejidos animales deben adherirse estrictamente a la aprobación del comité ético bajo las reglas y regulaciones locales. Todos los tejidos obtenidos durante este estudio adhirieron a la experimentación animal, el MRC-LMB. 1 Preparación de Materiales y Medios de Cultivo Preparar todas las soluciones con agua Millipore; utilizar únicamente reactivos de grado analítico. Preparar y almacenar todos los reactivos a temperatura ambiente (a menos que se indique lo contrario). Hacer 500 ml de solución salina tamponada con HEPES (HEPES 10 mM, NaCl 120 mM pH 7,2). Filtrar a través de una unidad de filtro estéril de 0,2 micras. Almacenar a 4 ° C. Hacer 500 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS; 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, pH 7,4). Esterilizar en autoclave. Preparar medio neuronal completándolo DMEM (medio de Eagle modificado de Dulbecco) con 25 mM HEPES, 10% de suero de ternera fetal, glucosa 30 mM, 1: 100 N2 dopplement, penicilina-estreptomicina 1.100 U / ml; pH 7,2. Filtro con una unidad de filtro estéril de 0,2 micras. Almacenar a 4 ° C. Hacer disolución de polivinilpirrolidona (PVP) stock con 20 mg de PVP en 1 ml de etanol al 100%. Alícuota de esto en 1 ml cantidades, congelación y almacenar a -20 ° C. Solución de trabajo es de 0,05 mg / ml, por lo tanto, añadir 10 l de solución de PVP de stock para cada 4 ml de etanol al 100%. Preparar una solución madre 0,05 M espermidina en agua Millipore; ajustar el pH a 7,2. Hacer una solución de agarosa al 2% en DMEM (2 g de agarosa de grado electroforesis en 100 ml de DMEM en una botella de tapón de rosca esterilizada). Microondas esto hasta que la agarosa se haya disuelto. Guarde en la nevera 4 ° C durante varias semanas, si es necesario. 2 Preparación de Organotípicos rebanadas La eutanasia a C57 Negro 6 ratones de la edad deseada por asfixia de CO 2 seguido por decapitación. Retire el cerebro usando recortes laterales del cráneo a partir de la foramen magnum y terminando enlos lóbulos olfativos. Levante suavemente el cráneo de la parte posterior para exponer el cerebro. Cortar entre los lóbulos olfativos y la corteza frontal, y a rostral del cerebelo. Levante ligeramente la parte rostral del cerebro y cortar los nervios ópticos. Por último, retire el cerebro y lo coloca en una placa de Petri llena con solución salina tamponada con HEPES frío de hielo en hielo. El uso de un microscopio de disección, retire la pia utilizando unas pinzas finas; retirar con cuidado los vasos sanguíneos y meninges alrededor del cerebro. Coloque el cerebro fresco en un molde receptor pequeño y cubra con la solución de agarosa enfriado ligeramente por encima de RT. Luego enfriar rápidamente el molde a 4 ° C colocándola en hielo. NOTA: Procesar las rebanadas lo más rápidamente posible para evitar la pérdida de viabilidad. Cuando la agarosa se ha fijado (5 – 10 min), retire el cerebro agarosa embebidos del molde (recortar si es necesario) y, a continuación, péguelo en la plataforma vibroslicer. Coloque esto en una cámara vibroslicer contiene hielo estéril PBS frío. Disinfect la cámara de vibroslicer antes de ser utilizado con etanol al 70% para reducir al mínimo las contaminaciones posteriores. Cortar el cerebro usando un vibroslicer hecha a la medida o su equivalente comercial. El concepto de modelo era diseñar una máquina de cortar el tejido que podría generar movimientos de gran amplitud y alta frecuencia horizontal hasta el borde de la cuchilla y reducir al mínimo las vibraciones verticales. Usa la frecuencia de oscilación de 90 Hz, a una amplitud de 1,5 – 2,0 mm, y la cuchilla de corte situado en un ángulo de 15 ° con el plano horizontal; establecer el bloque de montaje sosteniendo el cerebro de agarosa embebidos para mover a 1,7 mm / min hacia la cuchilla. Recoger secciones (150 micras) en una cámara que contiene un medio de cultivo frío en hielo (DMEM Pen / Strep + 10% FCS). Ver corte y manipulación de las rodajas de tejido como un video complementario en Arsenault y O'Brien 13. Con suavidad, coloque las rebanadas en insertos de cultivo celular (0,4 m, diámetro 30 mm) en una bandeja de 6 pocillos múltiples con las med culturaia en el exterior de la pieza de inserción, y se incuban en un incubador humidificado a 37 ° C con 5% de CO 2. NOTA: Para la viabilidad del tejido adecuado, ser muy suave, mientras que la transferencia y la manipulación de las rebanadas. También, demasiado líquido evitará que las rebanadas organotípicos se adhiera a la membrana del inserto de filtro. Si esto ocurre, retire el exceso de líquido o placa de nuevo. Aunque rebanadas organotípicos pueden ser cultivadas durante un par de semanas, procederá a la transfección no más de 4 días después de la siembra para obtener los mejores rendimientos de transfección. NOTA: Para evitar el crecimiento excesivo de la glía en condiciones de cultivo a largo plazo, el uso AraC o medio libre de suero 2. 3 Preparación de ADN recubierto Micro & Nano-proyectiles Preparar nano-proyectiles que utilizan partículas de oro de 40 nm de diámetro. Brevemente, se añaden 50 l de 0,05 M espermidina y 10 l de ADN en 1 mg / ml (pEYFP-N1) a 10 mg de partículas de oro. Añadir calcio y espermidina en la mezcla de solucióntura durante ADN micro-partículas de oro preparación con el fin de ayudar en la unión de moléculas de ADN a las nanopartículas de oro. NOTA: La cantidad de ADN utilizado por mg de portadores de oro (DLR), debe oscilar entre 1 y 5 g de ADN por 1 mg de oro. Además, la cantidad de partículas de soporte de oro que se rodará por cartucho (MLQ), debe sí variar de 0,1 a 0,5 mg de oro. El DLR y MLQ deben ser juzgados y optimizados para cada usuario dependiendo del sistema particular bajo investigación, así como el tipo de cañón de partículas y el gen utilizado. Mezclar utilizando un vórtice mientras que lentamente la adición de 50 l de 1 M de CaCl2 en fracciones de 10 – 15 l. Después de 5 min de agitación con vórtex ocasional, centrifugar a 1000 xg durante 30 segundos y luego eliminar el sobrenadante. Resuspender el precipitado de partículas de oro en 3,5 ml de 0,075 M PVP. Dibuje esta suspensión en un tubo (diámetro 2,36 mm interna) usando una jeringa. Colocar el tubo en la estación de preparación de tubos. Permitir elpartículas de oro se asienten y eliminar el sobrenadante por aspiración con una jeringa. Gire el tubo para repartir uniformemente las partículas de oro, que posteriormente fueron secados bajo un flujo constante de nitrógeno a 5 litros por min. Para crear ADN-balas, cortar el tubo con un cortador de tubo en longitudes de 1 cm. Cualquiera de insertar inmediatamente en el cartucho de pistola de genes o mantener desecado (4 ° C) hasta que se requiera. 4. biolística transfección en Organotípicos rebanadas Lleve a cabo los siguientes pasos dentro de una campana de flujo laminar estéril. Inserte una batería de 9 V y un soporte de cartucho vacío en la pistola de genes Helios. Coloque la pistola de genes para el tanque de helio con la manguera de helio. Fuego 2 – 3 espacios en blanco (ranuras vacías) a 50 psi para presurizar la manguera de helio y los depósitos en la pistola. Cargar los cartuchos que contienen el oro recubiertas de ADN en los soportes de los cartuchos y cargar el soporte en la pistola de genes. Desatornille el gen arma espaciador y adjuntarel cañón del arma gen modificado a la pistola de genes. Usando una pinza estéril, coloque un inserto de filtro que contiene la rebanada organotípico en un plato de plástico estéril. Retire el medio de rebanadas organotípicos. Ajuste la presión del gas a 50 psi. NOTA: La protección ocular es esencial y protección para los oídos aconsejable. Coloque la pistola de genes a las distancias apropiadas utilizando el montaje medido a 10 mm. Apuntar con cuidado el centro de la barril en la región deseada para la entrega genética. Después de la cocción, vuelva a colocar los insertos de nuevo en su plato con medio fresco y devolverlos a las condiciones de crecimiento normales, es decir, 37 ° C con 5% de CO 2 incubadora. Una vez terminado, cierre el tanque de helio, liberar la presión de la pistola de genes y separar la pistola de genes desde el tanque de helio. Retire el soporte del cartucho y deseche los cartuchos y limpiar la pistola de genes. Compruebe el tejido de la morfología y de la penetración exitosa de visualizing las rodajas usando un microscopio invertido. Si el uso de micropartículas, de manera uniforme dispersar el oro; no debe haber áreas densas de partículas de oro se ven en la división. Las nanopartículas debido a su pequeño tamaño no pueden ser vistos como unidades individuales por técnicas de microscopía convencionales. Después de que el intervalo de tiempo apropiado (normalmente 1 – 2 días), fijar las rebanadas en el 4% de paraformaldehído (PFA) para la observación de la microscopía. NOTA: La fijación de PFA no siempre se desea. Para imágenes de células vivas evitar este paso. 5. Fijación y Visualización de cerebro rebanadas Después de la transfección biolística, lavar rodajas dos veces en PBS durante 2 min. Fijar rebanadas incubando en recién hecho, hielo frío PFA al 4% en PBS durante 20 min. Lavar rodajas dos veces en PBS durante 2 min. Cortar suavemente alrededor de la membrana admite el uso de un bisturí, sin perturbar las rodajas montados en ellos. El uso de fórceps para colocar cada membrana de soporte / rebanada en un portaobjetos de microscopio. Descanse el organotyprebanadas ic en la parte superior de la membrana en el portaobjetos de vidrio. Añadir una gota de medio de montaje en la parte superior de la rodaja y añadir un cubreobjetos suavemente sin ninguna fuerza directamente en contacto con la rebanada organotípicos. Asegure el cubreobjetos con una fina capa de barniz de uñas. Ver las rebanadas en un microscopio adecuado. 6. Aplicaciones Confocal Visualizar las rodajas mediante el uso de un microscopio confocal láser de barrido vertical con una 60X / 1,4 apertura numérica (NA) de inmersión en aceite de lente de objetivo. NOTA: La característica más problemática del microscopio confocal es el tamaño del agujero de alfiler (puesta a 1 UA), que es capaz de aislar y recoger un plano de enfoque, eliminando así el fuera de foco 'bruma' se ve normalmente con una muestra fluorescente. Los detalles finos a menudo son oscurecidas por esta bruma y no pueden ser detectados en un microscopio nonconfocal. Ajuste el láser de argón a una longitud de onda de excitación de 488 nm y optimizar para la recogida de emitted luz en la banda de entre 500 y 520 nm. Típicamente, recoger imágenes a 1024 x 1024 píxeles y con las pilas de z secciones a intervalos de 0,5 m para abarcar la anchura completa de cada célula nerviosa que se analizó. Para observar la morfología del núcleo, contador mancha estas células con DAPI (longitud de onda de excitación fijado en 405 nm y de emisión de luz recogida entre 420-4 40 nm). Por último, para el examen de fluorescencia roja, ajuste el láser a 561 nm para la excitación y 565-620 nm para la emisión. Por lo general, la obtención de imágenes mediante el uso de un zoom 4X exploración que cubrió un área de 57,6 m 2; tamaños de las imágenes estaban en la región de 1.024 x 1.024 píxeles. Record pilas de z secciones en intervalos de 0,5 micras y proyecciones de 5-8 cuadros combinados.

Representative Results

Organotypic slice viability can be monitored with lactate dehydrogenase activity, propidium iodide labeling, and dUTP staining as was previously reported13,22. Evidently, the viability and integrity of the slices are important for the long-term sustained expression of the delivered genetic cargo. Following biolistic delivery into the organotypic slices, the expression of the fluorescent heterologous gene was monitored by confocal microscopy. The tightness of the biolistic spread using the modified barrel can be seen in Figure 3A. Figure 3B shows a representative image of the transfected hippocampus region using DNA coated gold nanoparticles. Figure 4 shows representative pictures of transfected adult mouse organotypic slices. As can be seen in Figure 4A, a Purkinje neuron with a remarkable dendritic harbor found at the interface of the Purkinje layer and the molecular layer of the cerebellum shows pronounced labeling following transient biolistic transfection with pEGFP-N1. Figure 4B shows a higher magnification of these dendrites where spines can be observed. Figure 4C shows a pyramidal cell found in the CA1 region of the hippocampus following biolistic delivery of pDSredFP coated gold nanoparticles. Dyes instead of fluorescent encoded DNA cargos can also be used in a similar manner to visualize morphological characteristics in organotypic slices. DiO, which labels the plasma membranes, can more rapidly delineate individual cell morphologies or can be used in conjunction with a DNA coated biolistic delivered to the same region to confirm the regioselection. As can be seen in Figure 5A a neuron stained with DiO in the hippocampus also shows long dendrites with numerous spines. An arrow indicates the axon which is identified by the presence of synaptic boutons in comparison to the dentritic spines on the other neurites. Figure 5B shows another example of the CA1, which highlights numerous hippocampal projections with a DAPI counter stain to label the nucleus. Figure 5C shows a higher magnification of these types of parallel dendrites with numerous spines. Evidently, these images illustrate morphological characteristics following cellular labeling. Nothing precludes the same methodology from being applied to deliver any number of exogenous genes coated onto the gold nanoparticles. To permit a visual confirmation of successful transfection, a single plasmid can be constructed to co-express both the gene of interest and a fluorescent reporter protein on the same vector. Figure 1. Gene gun barrel and mounting. (A) The improved barrel developed by Dr. O'Brien at the MRC-LMB that has a restricted biolistic spread that minimizes tissue damage by lowering the required pressure for particle acceleration. (B) The side view of an optimized gene gun mounting developed by Dr. Henderson and Dr. Andras Nagy at the University of Toronto. The mounting holds the gene gun at precisely 90˚ perpendicular to the organotypic slices while permitting the user to accurately control the distance of biolistic delivery. For optimal biolistic conditions the barrel aperture should be placed directly over the region of interest at a 10 mm distance from the organotypic slices. (C) Back view of the gene gun mounting. The region of interest to be transfected needs to be placed directly underneath the barrel aperture. Targeting can be confirmed with dye (diolistic) or fluorescent protein tranfection (biolistic). Please click here to view a larger version of this figure. Figure 2. Organotypic slice preparation and regioselective targeting. (A) A DMEM embedded adult mouse brain ready for slicing. (B) The mould was glued onto the vibroslicer mounting with the blade ready to cut a slice. (C) Regioselective heterologous gene expression strategies for biolistic delivery into coronal organotypic brain slices. Images prepared from pictures obtained from the Allen Brain Atlas anatomical reference atlas23. Left panel shows two different brain regions targeted as an example. To restrict the gene expression (1) to the cortical area of the left hemisphere. To restrict the heterologous gene expression (2) to the hypothalamus region of the brain. Middle panel shows that the expression of two heterologous genes (3 and 4) can be isolated and compares the hippocampus of two hemispheres in the same organotypic slice, essentially eliminating any bias from using different sections and/or granting the possibility to address distal crosstalk from the effects of those genes. Right panel shows the possible overlap of transgenic delivery to express the first gene (5) in a precise cortical region while expressing another gene (6) in a disparate yet overlapping cortical area. This permits to analyze the effect of genetic modulation of each heterologous gene alone and also in combination within the same slice. Please click here to view a larger version of this figure. Figure 3. Biolistic scatter pattern seen on filter paper and low magnification image. (A) The improved barrel was fired onto filter paper to determine the spread of gold particles. Left side shows the distribution of the improved barrel while the right panel shows the normal barrel. Black bar: 1 cm. Image taken from O'Brien, et al.17. (B) Low magnification image showing the stochastic transfection patter within the 3 mm biolistic spread within the hippocampal region of 6 week old mice. White bar: 100 µm. Please click here to view a larger version of this figure. Figure 4. Biolistic delivery of fluorescent protein encoded DNA into organotypic slices of 6 week old mice. (A) Inverted confocal images of a fixed organotypic slice of the cerebellum of a pEGFP-N1 coated gold particles transfected Purkinje cell. Image was taken at 40X magnification. Black bar: 30 µm. (B) Shows a 60x magnification of another Purkinje cell's dentritic harbor to highlight the spines. Black bar: 5 µm. (C) Shows a confocal image of fixed slices taken from the hippocampal region at 60x magnification of four DSredFP transfected pyramidal cells. Black bar: 10 µm. Please click here to view a larger version of this figure. Figure 5. Diolistic delivery of membrane labeling fluorescent dyes into organotypic slices. (A) shows the live imaging of a hippocampal neuron labeled with DiO under 20X magnification. The dentritic spines can clearly be observed as well as the axon as identified by the absence of dentritic spines and the presence of synaptic boutons indicated by a white arrow. White bar: 30 µm. (B) Pronounced staining of the hippocampal region labeled with DiO and counterstained with DAPI. White bar: 30 µm. (C) Higher magnification (60x) of the dentritic spines found in the CA1 region of the hippocampus. White bar: 5 µm. Please click here to view a larger version of this figure.

Discussion

The protocol describes approaches to deliver dyes and genetic materials into adult organotypic slices by using an enhanced gene gun. Essentially, the types of dyes and the variety of possible genes make this method multifaceted and amenable to answer a wide range of biological questions. The regioselective delivery method used, in this case to specific brain region, opens new avenues for experimentation as heterologous gene modulation of localized areas within a biologically relevant architecture hasn't been easily feasible before. We have previously determined that this method can be used on adult organotypic slices, where mature synapses are fully formed, as it showed improved cell survival and heterologous gene expression for many weeks¹³. With the advent of new and improved culture conditions for mammalian brains as well as other tissues, the use of regioselective genetic modulations will become increasingly useful for a wide variety of biochemical analyses.

As we shall highlight here and previously mentioned by others²⁴, many different factors could readily affect the accuracy and reliability of biolistic delivery. Firstly, the preparation of the gold particle linked to dyes or DNA must be adequately balanced to prevent aggregation and to facilitate the cartridge cargo expulsion. Calcium and spermidine in the DNA-gold micro particles solution can aid the binding of DNA molecules to the gold nanoparticles. The ability for the nanoparticles to penetrate the cells under reduced pressure was previously determined¹⁷. Secondly, the gene gun must be mounted as steady as possible with the correct angle and distance. A reliable pressure gauge is also necessary for reproducibility, to maintain tissue integrity, and to properly accelerate the gold particles to their intended targets. Indeed, the distance, orientation, and stability of the equipment are also a crucial factors for the targeting and precision of regioselective delivery. As these brain structures are very small, minor variations in the firing angle could easily render the entire procedure less reliable. And finally, the preparation and maintenance of viable organotypic slices have been fraught with difficulties for many decades yet abundant and reliable protocols for different animals, brain regions, ages and cocultures are currently available^2,4,25,26. These procedures should be user-optimized before submitting the tissues to biolistic procedures. This will more readily permit the user to unbiasedly ascertain the impact of the biolistic particles and the effect of the heterologous gene on their own cultures. To this end, the use of fluorescent genes such as EYFP and EGFP can both permit a novel user to test the targeting precision and also follow the cellular viability through heterologous gene expression over a sustained period of time¹³. Many of the critical steps for reliable and reproducible use of this protocol are highlighted in the following three paragraphs.

For efficient transfection, the DNA concentration must be appropriate. Concentrations that are too low would hinder the transfection yield while concentrations that are too high can cause agglomeration of the nanoparticles. Aggregates of gold can dramatically reduce transfection efficiency, cause uneven distributions, and can lead to increased cytotoxicity and oxidative stress. Problems with coating efficiency are likely due to the expiration of the spermidine solution (should be replaced every 2 to 3 months). For an adequate biolistic spread, the labeling must be even. A non-homogeneous labeling of the gold nanoparticle/DNA suspension may be due to the PVP solution. It should also be replaced every 2 to 3 months. Coating of the gold nanoparticles can be seen on agarose gel electrophoresis as a higher MW band²⁷.

Each biological system under investigation as well as each different instrument used might require small changes in gas pressure to reach optimized levels of transfection and biolistic spread. The critical parameter is the pressure of the helium pulse required to strip the micro- or nano-carriers from the plastic cartridge and propel them into the tissue. A high gas pressure will affect cell survival, because it will create shock waves across the target and disrupt or detach the tissue from the matrix¹⁷. Aiming the gene gun barrel and having the apparatus exactly perpendicular to the tissue is important for accurate biolistic delivery. The selected area should be placed in the direct center of the barrel at precisely 10 mm from the outer aperture. This results in a 3 mm diameter of gold particle delivery around the epicenter. The gene gun barrel should be cleaned with 70% ethanol after each use. To protect the tissue from large particle aggregates, the barrel also contains a nylon mesh that should be replaced regularly to maintain optimum performance. In order to replace the mesh unscrew the cap then insert a new nylon mesh between the cap and the O-ring.

Fluorescently labeled cells should be visible at least 1 – 2 days after transfection around the epicenter. Absence or misalignment of labeling can result from inadequate preparation and instability of the gene gun mounting. The observations of cells using confocal microscopy depends on a number of factors: the wavelength of the excitation/emission light, pinhole size, NA of the objective lens, refractive index of components in the light path, depth of the tissue, and the alignment of the instrument. These factors should be optimized for each system under investigation.

Recent advances in biolistics were exploited for the success of this method. The gene gun barrel used in this study was modified in order to reduce the pressure necessary as well as funnel the biolistic scatter pattern into a more constrained and specific area^17,19. Other barrel modifications have tried to restrict the biolistic spread and reduce the outflow pressure²⁸ yet this custom designed gene gun barrel designed by Dr. O'Brien is a single component fitted to the standard Helios Gene gun. Subsequently, sub-micrometer gold particles were used to reduce the invasiveness of micrometer particles that we had previously determined caused cellular damage and ultimately, loss of sustained heterologous gene expression. These changes to the biolistic procedure improved the overall feasibility and reproducibility of the method¹³. Other improvements on slice preparation such as in-depth troubleshooting of the slicing procedure, using a DMEM-Agarose matrix to preserve the brain, and numerous other useful advances in organotypic brain slice preparation previously reported¹³ enabled us to explore the use of adult slices that have developed mature synaptic networks.

In our study we mainly used dyes and fluorescent heterologous genes to visualize cell morphology as a readout on transfection efficiency and an ability to image the morphological characteristics of neurons in mouse brain tissues. The signal to noise ratio of the stochastic delivery within a defined radius enabled us to completely isolate a single cell's dentritic harbor within its native context. As numerous efforts are used to investigate these morphological characteristics, mapping 'connectomics' or to label single cells for various analyses, this method could easily be combined with existing protocols such as electrophysiology and neurite measurements^29,30. Evidently, combinations of fluorescent heterologous genes could enable a much more robust delineation of single cells as the stochastic distribution of fluorescent proteins, and their combination would determine the color of the individual cells^31,32. The use of cell specific promoters such as synapsin and glial fibrillary acid protein upstream of the heterologous gene exon can also restrict the expression to subpopulations³³. Indeed, the unending variety of genetic material could also be delivered in a regioselective manner by gold nanoparticles using this same procedure. The total transfected regions could thus be analyzed with traditional methods, such as dissection and submitting that region to western immunoblotting to analyze the localized effect of the heterologous gene.

Improvements in organotypic slice procedures will also permit wider use of brain tissues for long-term experimentation as well as permit the use of other tissues and cocultures and would facilitate transfection procedures. Lipid and polymer transfection have been previously reported to affect membrane homeostasis, internalization, protein permeability³⁴ and frequently show very low efficiency to transfect terminally differentiated neurons. Cell specific cargo targeting is also amenable only to cells that express the cell surface receptors needed for internalization, and although this method can be highly selective, it can lack targeted regioselectivity³⁵. Viral vectors otherwise are often difficult and costly to produce, require stringent regulations and have on occasion demonstrated safety concerns. Biolistic delivery thus has an unparalleled ability to regioselectively transfect neurons and other cell types within viable tissues. As gold is non toxic, further advances in the use of biolistics could pave the way for biomedical uses such as transdermal pharmaceutical delivery, noninvasive in vivo gene delivery, as well as localized nonviral gene therapies.

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Helios gene gun system	Bio Rad	165-2431	Gene gun and tube prep station
HEPES	Sigma	83264-100ML-F
NaCl	Sigma	S7653-250G
KCl	Sigma	P9333-500G
Na2HPO4	Sigma	S7907-100G
KH2PO4	Sigma	P9791-100G
0.2 µm sterile filter unit	Millipore	SCGPU05RE	to filter media
DMEM	Gibco	21885-025
Fetal calf serum	Gibco	10270-098
D-Glucose	Sigma	G8270-100G
N2	Life Technologies	17502-048
Penicillin/Streptomycin	Sigma	p4333
Polyvinylpyrrolidone	Sigma	856568-100G
Ethanol	Sigma	277649-100ML
Spermidine	Sigma	S2626
Agarose	Bio Rad	161-3100EDU
Vibroslicer	Laica	VT1200	We used a custom design
Gene gun mount			Built in house at U of T
Humidified cell culture incubator
Gold nanoparticles	cytodiagnostics	G-40-20
pEYFP-N1	Clontech
Tubing cutter	Bio Rad	165-2422
Tefzel tubing	Bio Rad	165-2441
Barrel			Custom made by the LMB
Cell culture insert	Millipore	PICM0RG50
Paraformaldehyde	Sigma	76240 Fluka
Dissecting microscope			for convenience
Confocal microscope			user defined for usage
Glass slide	VWR	2588-CA48323-185
Microcover glass	VWR	2448-CA48366-067-1
Vectashield mounting media	Vector laboratories	H-1400