Summary

ل<em> فيفو السابقين</em> يسببها الليزر اصابات الحبل الشوكي نموذج لتقييم آليات محور عصبي تنكس في الوقت الحقيقي

Published: November 25, 2014
doi:

Summary

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Abstract

فشلت محاور CNS المصابين إلى تجديد وغالبا ما تتراجع بعيدا عن موقع الإصابة. محاور تنج من الإصابة الأولية قد يخضع لاحقا انحطاط محواري الثانوي. عدم تشكيل مخروط النمو، والتجديد، وفقدان التوقعات محور عصبي مياليني إضافية داخل الحبل الشوكي يحد بشكل كبير الانتعاش العصبية التالية الإصابة. لتقييم مدى أهمية myelinated محاور عصبية من الحبل الشوكي تستجيب للإصابة، وضعنا على فيفو السابقين الذين يعيشون نموذج الحبل الشوكي باستخدام الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتين أصفر فلوري في المحاور والوصل واستنساخه للغاية إصابات الحبل الشوكي التي يسببها الليزر لتوثيق مصير محاور والمايلين (محبة للدهون صبغة الفلورسنت النيل الأحمر) مع مرور الوقت باستخدام اثنين من الفوتون الإثارة الوقت الفاصل بين المجهري. العمليات الديناميكية مثل الإصابة الحادة محور عصبي، تراجع محور عصبي، وانحطاط المايلين هي أفضل درس في الوقت الحقيقي. ومع ذلك، فإن الطبيعة غير المحورية لإصابات القائم على كدمة والتحف واجهت الحركةخلال المجراة الشوكي جعل التصوير الحبل التفريق الردود إصابة محور عصبي الابتدائية والثانوية باستخدام عالية الدقة المجهر تحديا. وفيفو السابقين نموذج الحبل الشوكي هو موضح هنا يحاكي جوانب عديدة من كدمة / التي يسببها ضغط الأمراض محور عصبي ذات الصلة سريريا بما في ذلك تورم محور عصبي، وتشكيل كروي، transection محور عصبي، وشبه محواري تورم تقديم نموذجا مفيدا لدراسة هذه العمليات الدينامية في الوقت الحقيقي. المزايا الرئيسية لهذا النموذج هي قرار الزماني المكاني الممتاز الذي يسمح التمايز بين إهانة الأولية أن يجرح مباشرة محاور وآليات الإصابة الثانوية؛ ضخ تسيطر عليها من الكواشف مباشرة إلى الاستحمام سائل الإرواء الحبل. التعديلات دقيقة من الوسط البيئي (على سبيل المثال، والكالسيوم، أيونات الصوديوم، والمساهمين المعروف أن الإصابة محور عصبي، ولكن بالقرب من المستحيل التلاعب في الجسم الحي)؛ ونماذج الفئران كما تقدم ميزة لأنها توفر فرصة لتصور والتلاعب السكان الخلية التي تم تحديدها وراثيا والهياكل التحت خلوية. هنا، نحن تصف كيفية عزل وصورة الحبل الشوكي الحية من الفئران لالتقاط ديناميات إصابة محور عصبي حاد.

Introduction

انحطاط المحاور هو سبب بارز للمراضة والتي تمتد عدة شروط العصبية بما في ذلك رضح عصبي والسكتة الدماغية وأمراض المناعة الذاتية، والأمراض العصبية. وخلافا للنظام العصبي المحيطي (السندات الإذنية)، والجهاز العصبي المركزي (CNS) محاور لديها قدرة محدودة على التجدد أصيب مرة واحدة على حد سواء بسبب الحواجز الجوهرية وخارجي (أي الجزيئات المثبطة لنمو محور عصبي أنتجت خلال تشكيل ندبة وحررت خلال انحطاط المايلين) 1 -7. على الرغم من أن العديد من هذه الحواجز قد تم استكشافها على نطاق واسع، والتدخلات العلاجية التي تهدف لمنع CNS انحطاط محور عصبي، وتعزيز تجدد المحاور قوي، واستعادة connectively وظيفية، تظل محدودة.

محاور مرة واحدة وفصلها عن سوما على الخضوع لعملية النمطية للانحطاط المعروفة باسم ولري انحطاط التي تتميز تورم محور عصبي، وتشكيل كروي والتفتت في نهاية المطاف (استعراضها في 8). فيالنقيض من ذلك، الجدعة الداني أن يبقى في الاستمرارية مع سوما من محور عصبي محيطي مقطوع، يشكل تورم في نهايته، يموت العودة إلى أقرب عقدة رانفييه، ومن ثم يمكن بدء تشكيل مخروط النمو، وهو شرط أساسي حيوي ضروري لتجدد المحاور لاحق 9-11. في المقابل، فإن النهايات محور عصبي القريبة من العديد من المحاور المركزية تشكل "endbulbs" سمة أو المصابيح التراجع، تفشل في تشكيل مخاريط النمو، وبدلا من التراجع بعيدا عن موقع الإصابة حيث تبقى لأشهر بعد الإصابة 12-15. بالإضافة إلى إصابة محور عصبي الأولية، قد تحدث إضافية محور عصبي الضرر / الخسارة أيضا إلى المحاور التي نجت إلى حد كبير من الإصابة الأولية. ويشار إلى هذا تأخر فقدان محور عصبي من المحاور يدخر في البداية إلى انحطاط محور عصبي الثانوي. هذا الرد المتأصلة من المحاور CNS إلى إصابة يجعل تجدد المحاور وظيفية هدفا أكثر صعوبة لتحقيق في الدماغ والحبل الشوكي.

وعلى الرغم من هكتارllmarks الإصابة محور عصبي (على سبيل المثال، وتشكيل كروي، والمصابيح تراجع) اتسمت جيدا من الأنسجة بعد الوفاة ونماذج تجريبية من انحطاط محور عصبي، وقد تم تقييد توضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه العمليات الديناميكية. تعتمد معظم هذه الدراسات على الملاحظات نقطة النهاية الثابتة التي فشلت بطبيعتها لالتقاط الردود محور عصبي الفردية مع مرور الوقت. على الرغم من تطبيقها خارجيا كانت استشفاف محور عصبي مفيد لتوضيح الردود محواري من أقسام ثابتة وخلال التصوير الحي، وتوافر علامات محور عصبي المشفرة وراثيا قد تحسنت كثيرا قدرتنا على تصور محاور في الوقت الحقيقي باستخدام المجهر مضان. في الواقع، قدمت تقريرا المنوي من Kerschensteiner وزملاؤه أول دليل مباشر على انحطاط محور عصبي والتجديد في الجسم الحي باستخدام Thy1 -GFP-S الفئران التي تكود البروتين الفلوري الأخضر في مجموعات فرعية من الخلايا العصبية التي ترسل توقعاتهم في الأعمدة الظهرية من العمود الفقريالحبل 16. تصوير حي النهج باستخدام اثنين من الفوتون المجهري المسح الضوئي ليزر (TPLSM) ويستمر الجيني وضع العلامات بروتين فلوري الخلايا التي تهم تقديم أدلة مباشرة والبصيرة الميكانيكية في العديد من العمليات الحيوية المختلفة مثل التنكس محور عصبي، كاليفورنيا 2+ الإشارات، تجدد المحاور، نجمية علم وظائف الأعضاء، علم وظائف الأعضاء دبقية، واستجابة لإصابات 17-25.

وعلى النقيض من محاور عصبية، لا يعرف إلا القليل جدا من الردود المايلين الاصابة في الوقت الحقيقي. المايلين هو مكون أساسي من مكونات المادة البيضاء المنتجة والتي تحتفظ بها قليلة التغصن في خلايا الجهاز العصبي المركزي والجهاز العصبي المحيطي شوان في. المايلين يعزل 99٪ من سطح محاور وبذلك يوفر عالية المقاومة ومنخفضة السعة أغطية واقية التي تدعم نشر دفعة قفزي السريع والفعال، استعرض مؤخرا من قبل Buttermore وآخرون. 26. للقبض على الاستجابة الديناميكية المايلين إلى إصابة نستخدم solvatochromic، محبة للدهونصبغة الفلورسنت النيل الأحمر 27. خصائص solvatochromic هذا وصمة عار الحيوية تسمح التحولات الطيفية من الطيف الانبعاثات التي تعتمد على البيئة الفيزيائية والكيميائية 28،29. هذه الخصائص هي مفيدة لاكتساب نظرة ثاقبة آليات الإصابة axomyelinic ويمكن تصور استخدام dichroics اختيار مناسب والمرشحات الانبعاثات أو حلها باستخدام المجهر الطيفي 27. على سبيل المثال، النيل الأحمر طيف الانبعاث هو الأزرق تحول في بيئات غنية بالدهون أقل القطبية مثل تلك الموجودة في الخلايا الشحمية وطبيعية CNS المايلين (الانبعاثات ذروة ~ 580-590 نانومتر) 27. في المقابل، قمم طيف الانبعاث هذه الصبغة الحيوية في في ~ 625 نانومتر في endbulbs كما شكلت محاور تخضع السقم محور عصبي 27. على الرغم من أن الآليات الدقيقة الكامنة وراء هذه التحولات الطيفية تحديدا في endbulbs مقابل المايلين طبيعيا لا تزال غير واضحة، قد مثل هذه التغييرات الطيفية تكشف عن التعديلات الأساسية في تراكم البروتين أو الفوضى مما أدى إلىتعرض مواقع الربط مسعور 27.

بينما التصوير في الجسم الحي هو المقياس النهائي لمراقبة الحبل الشوكي ديناميات إصابة محور عصبي في بيئتهم المحلية، فمن الصعب فنيا ويتطلب خبرة جراحية كبيرة، وغالبا ما يكرر عملية جراحية لفضح العمود الظهري التي قد يعرض القطع الأثرية التجريبية (على سبيل المثال، والتهاب وندبة التأسيس). وبالإضافة إلى ذلك، في كثير من الأحيان هناك حاجة إلى معدات مكلفة للسماح للتعليق وتحديد المواقع حيوان سليمة تحت المجهر عدسة موضوعية. تحتاج الحيوانات التي يتعين رصدها بعناية وكذلك لضمان أنها لا تزال دافئة، لضمان تجديد السوائل، وضمان عدم وجود علامات نقص الأكسجين بسبب جلسات التصوير تخدير لفترة طويلة. وهذا الأخير هو في غاية الأهمية كما المحاور والمايلين تتطلب تماما نضح المستمر ومستويات الأكسجين الكافية لتبقى قابلة للحياة. ومع ذلك، وهذا هو في كثير من الأحيان لم يبلغ عنها أو رصدها في معظم الدراسات المجراة لالتاريخ. وبالإضافة إلى ذلك، والتحف الحركة نظرا لمعدل ضربات القلب والتنفس (الأيزوفلورين تخدير الماوس الكبار: ~ 300-450 نبضة في الدقيقة (BPM) هو الأمثل للحفاظ على 97-98٪ تشبع الأكسجين (المعدل الطبيعي ~ 632 BPM) و ~ 55-65 الأنفاس لكل دقيقة (المعدل الطبيعي هو ~ 163 نفسا في الدقيقة)، على التوالي)) 30 واجهتها خلال المجراة الشوكي جعل التصوير الحبل التفريق الردود إصابة محور عصبي الابتدائية والثانوية باستخدام عالية الدقة مضان المجهر تحدي حتى أسرع المسح الضوئي الليزر هي حتما تخضع لهذه الحركة التحف. التقدم في فائق السرعة الماسحات الضوئية الرنانة جنبا إلى جنب مع جامدة الفقري نافذة زرع مؤطرة قد يسمح التصوير من الحبل الشوكي الفئران في الحيوانات المستيقظة، ولكن مرات أسرع المسح الضوئي حتما يقلل من إشارة إلى نسبة الضوضاء جودة الصورة المهينة. المزيد من التحسينات في تقنيات التصوير الحبل الشوكي تستخدم حاليا لتصوير الدماغ قد التغلب على كثير من هذه العقبات وتحد يفند المحتملة التي أدخلتها ماننضح الأنسجة dequate، على سبيل المثال، 31-33.

وقد تم تحديد معظم ما هو معروف عن البيض علم وظائف الأعضاء وآليات الإصابة المادة البيضاء مسألة استخدام في المختبر أو خارج الحي الاستعدادات من المادة البيضاء من العصب البصري، الأعصاب الطرفية، وشرائح من الحبل الشوكي المادة البيضاء 34-41. استمرت هذه التحضيرات لدفع معرفتنا آليات إصابة المادة البيضاء، التي تسمح تسيطر التغيرات في العوامل البيئية، وتطبيق رقابة من الأدوية والكواشف، وتقييمات الوظيفية باستخدام الكهربية، والملاحظات مضان المجهر مباشرة من المحاور والميلين في الأنسجة الحية. ومع ذلك، وبعض الأساليب السابقة لمراقبة محاور عصبية من الحبل الشوكي شرائط العمود الظهري البطني أو شرائط المادة البيضاء حتما تجرح محاور السطح خلال مرحلة إزالة التي قد تؤثر على استجابة من المحاور تعارض بشكل وثيق. للاستفادة من التلاعب التجريبية أعلاه وتجنب الأضرار التي لحقت هاءالألياف راي قيد التحقيق، ونحن نستخدم نموذج الحبل الشوكي العنقي خارج الحي كما أنه يمنع الاتصال المباشر من الجانب الظهري للحبل. وهكذا، فإن بنية الأم الحنون والمجاورة محاور العمود الظهري سطحية لا تزال قابلة للحياة ورابط الجأش أثناء العزلة.

نحن هنا وصف نهج بسيط نسبيا التي تسمح التصور المباشر لmyelinated محاور عصبية مركزية كما أنها تستجيب بشكل ديناميكي لإصابة تنسيق في الوقت الحقيقي يصل إلى 8 – 10+ ساعة بعد الإصابة. إصابة الحبل الشوكي (LiSCI) نموذج الليزر التي يسببها يسمح التفريق بين آليات إصابة محور عصبي الابتدائية والثانوية والآفة الأولية (الموقع الاجتثاث) ما زال مقيدا مكانيا مع مرور الوقت. غرفة التصوير حمام مفتوح يمكن الوصول إلى التدخل العلاجي، والتسليم الكاشف، والتلاعب البيئية. وكلاء واقية axomyelinic المفترضة يمكن تقييم بسرعة في الوقت الحقيقي من خلال الملاحظات المباشرة مقابل تجارب طويلة ومكلفة تنطوي عملية النسيججي، باجتزاء، المناعية، والتقاط الصور، والتحليل، وبالتالي تقدم نموذجا بديل مفيد لتقييم الردود الحادة والتلاعب وقائية قبل اختبار وكلاء التجريبية في الحيوانات الحية.

Protocol

ملاحظة: تم تنفيذ كافة الإجراءات الحيوانية في إطار المبادئ التوجيهية التي وضعتها لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة لويزفيل، والتمسك اللوائح الاتحادية. 1. إعداد منخفضة الكالسيوم 2+ و 2 ملي ك…

Representative Results

تفاصيل مختبر المناسب اقامة اللازمة لعزل، والحفاظ على قدرتها على البقاء، وصورة يظهر الحبل الشوكي خارج الحي في الشكل 1. ويحتاج المجهر لتكون مجهزة ليزر الفيمتو ثانية الانضباطي نابض، dicroics الاقتضاء والمرشحات الانبعاثات، والإمداد غمس عدسة موضوعية مع فتحة ع…

Discussion

نحن تصف طريقة التصوير خارج الحي الحبل الشوكي محاور العصبي (أي الحزمة النواة الناحلة) جنبا إلى جنب مع إصابة الحبل الشوكي التي يسببها الليزر لدراسة تطور ديناميكي كل من انحطاط محور عصبي مياليني الابتدائي والثانوي مع مرور الوقت. خارج الحي التصوير من سطح ال…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

DPS acknowledges past and present support in part from grant #2665 and #2934, respectively, from the PVA Research Foundation. PKS is an Alberta Innovates – Health Solutions Scientist, operating funds were provided by the Leblanc Chair for Spinal Cord Research, University of Calgary.

Materials

Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Large bath chamber with slice supports Warner Instruments RC-27L For ex vivo imaging chamber
Standard Slice Supports Warner Instruments SS-3 For ex vivo imaging chamber
Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers Warner Instruments SHD-27LP/10 For ex vivo imaging chamber
Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed Warner Instruments ST-1L For ex vivo imaging chamber
Solution In-line heater/cooler Warner Instruments SC-20 To regulate perfusate temperature during imaging
Bipolar temperature controller Warner Instruments CL-100 To regulate perfusate temperature during imaging
Liquid Cooling System Warner Instruments LCS-1 To regulate perfusate temperature during imaging
Cable assembly for heater controllers Warner Instruments CC-28 To regulate perfusate temperature during imaging
Replacement bead thermisitor for CC-28 cable Warner Instruments TS-70B To regulate perfusate temperature during imaging
Magnetic holder with suction tubing Bioscience Tools MTH-S To hold the stainless steel vacuum suction tubing 
Adjustable holder Bioscience Tools MTH To hold the temperature probe
clear silicone sealant For ex vivo imaging chamber
superglue For ex vivo imaging chamber
thin plexiglass strips For ex vivo imaging chamber
nile red Life Technologies N-1142 For labeling myelin

References

  1. Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).
  2. Eva, R., Andrews, M. R., Franssen, E. H., Fawcett, J. W. Intrinsic mechanisms regulating axon regeneration: an integrin perspective. Int Rev Neurobiol. 106, 75-104 (2012).
  3. McCall, J., Weidner, N., Blesch, A. Neurotrophic factors in combinatorial approaches for spinal cord regeneration. Cell Tissue Res. 349, 27-37 (2012).
  4. Pernet, V., Schwab, M. E. The role of Nogo-A in axonal plasticity, regrowth and repair. Cell Tissue Res. 349, 97-104 (2012).
  5. Bradbury, E. J., et al. Chondroitinase ABC promotes functional recovery after spinal cord injury. Nature. 416, 636-640 (2002).
  6. Cregg, J. M., et al. Functional regeneration beyond the glial scar. Exp Neurol. 253, 197-207 (2014).
  7. Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322, 963-966 (2008).
  8. Coleman, M. P., Freeman, M. R. Wallerian degeneration, wld(s), and nmnat. Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).
  9. Sulaiman, W., Gordon, T. Neurobiology of peripheral nerve injury, regeneration, and functional recovery: from bench top research to bedside application. Ochsner J. 13, 100-108 (2013).
  10. Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 13, 183-193 (2012).
  11. Erturk, A., Hellal, F., Enes, J., Bradke, F. Disorganized microtubules underlie the formation of retraction bulbs and the failure of axonal regeneration. J Neurosci. 27, 9169-9180 (2007).
  12. Seif, G. I., Nomura, H., Tator, C. H. Retrograde axonal degeneration ‘dieback’ in the corticospinal tract after transection injury of the rat spinal cord: a confocal microscopy study. J Neurotrauma. 24, 1513-1528 (2007).
  13. Fishman, P. S., Mattu, A. Fate of severed cortical projection axons. J Neurotrauma. 10, 457-470 (1993).
  14. McPhail, L. T., Stirling, D. P., Tetzlaff, W., Kwiecien, J. M., Ramer, M. S. The contribution of activated phagocytes and myelin degeneration to axonal retraction/dieback following spinal cord injury. Eur J Neurosci. 20, 1984-1994 (2004).
  15. Stirling, D. P., et al. Minocycline treatment reduces delayed oligodendrocyte death, attenuates axonal dieback, and improves functional outcome after spinal cord injury. J Neurosci. 24, 2182-2190 (2004).
  16. Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
  17. Kalb, J., Nielsen, T., Fricke, M., Egelhaaf, M., Kurtz, R. In vivo two-photon laser-scanning microscopy of Ca2+ dynamics in visual motion-sensitive neurons. Biochem Biophys Res Commun. 316, 341-347 (2004).
  18. Hirase, H., Qian, L., Bartho, P., Buzsaki, G. Calcium dynamics of cortical astrocytic networks in vivo. PLoS Biol. 2, 96 (2004).
  19. Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Long- and short-term intravital imaging reveals differential spatiotemporal recruitment and function of myelomonocytic cells after spinal cord injury. J Physiol. 591, 4895-4902 (2013).
  20. Canty, A. J., et al. In-vivo single neuron axotomy triggers axon regeneration to restore synaptic density in specific cortical circuits. Nat Commun. 4, 2038 (2013).
  21. Dibaj, P., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58, 1133-1144 (2010).
  22. Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).
  23. Nimmerjahn, A. Two-photon imaging of microglia in the mouse cortex in vivo. Cold Spring Harb Protoc. 2012, (2012).
  24. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
  25. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nat Commun. 3, 1227 (2012).
  26. Buttermore, E. D., Thaxton, C. L., Bhat, M. A. Organization and maintenance of molecular domains in myelinated axons. J Neurosci Res. 91, 603-622 (2013).
  27. Stirling, D. P., et al. Toll-like receptor 2-mediated alternative activation of microglia is protective after spinal cord injury. Brain. 137, 707-723 (2014).
  28. Greenspan, P., Fowler, S. D. Spectrofluorometric studies of the lipid probe, nile red. J Lipid Res. 26, 781-789 (1985).
  29. Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100, 965-973 (1985).
  30. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb Protoc. 2011, (2011).
  31. Tajima, Y., et al. Cerebral hemodynamic response to acute hyperoxia in awake mice. Brain Res. 1557, 155-163 (2014).
  32. Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80, 900-913 (2013).
  33. Nimmerjahn, A., Mukamel, E. A., Schnitzer, M. J. Motor behavior activates Bergmann glial networks. Neuron. 62, 400-412 (2009).
  34. Tsutsui, S., Stys, P. K. Metabolic injury to axons and myelin. Exp Neurol. 246, 26-34 (2013).
  35. Matute, C., Ransom, B. R. Roles of white matter in central nervous system pathophysiologies. ASN Neuro. 4, (2012).
  36. Matute, C. Calcium dyshomeostasis in white matter pathology. Cell Calcium. 47, 150-157 (2010).
  37. Stys, P. K., Lipton, S. A. White matter NMDA receptors: an unexpected new therapeutic target. Trends Pharmacol Sci. 28, 561-566 (2007).
  38. Baltan, S. Surviving anoxia: a tale of two white matter tracts. Crit Rev Neurobiol. 18, 95-103 (2006).
  39. Stirling, D. P., Stys, P. K. Mechanisms of axonal injury: internodal nanocomplexes and calcium deregulation. Trends Mol Med. 16, 160-170 (2010).
  40. Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues. Biophys J. 89, 581-591 (2005).
  41. Beirowski, B., Nogradi, A., Babetto, E., Garcia-Alias, G., Coleman, M. P. Mechanisms of axonal spheroid formation in central nervous system Wallerian degeneration. J Neuropathol Exp Neurol. 69, 455-472 (2010).
  42. Shi, R., Asano, T., Vining, N. C., Blight, A. R. Control of membrane sealing in injured mammalian spinal cord axons. J Neurophysiol. 84, 1763-1769 (2000).
  43. Stirling, D. P., Cummins, K., Wayne Chen, ., R, S., Stys, P. Axoplasmic reticulum Ca(2+) release causes secondary degeneration of spinal axons. Ann Neurol. 75, 220-229 (2014).

Play Video

Cite This Article
Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time. J. Vis. Exp. (93), e52173, doi:10.3791/52173 (2014).

View Video