En<em> Ex Vivo</em> Laser-indusert ryggmargsskade Model å vurdere Mekanismer av aksonal degenerasjon i sanntid

Summary

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Abstract

Skadde CNS aksoner klarer å regenerere og ofte trekkes bort fra skadestedet. Aksoner forskånet fra den første skade kan senere gjennomgå sekundær aksonal degenerasjon. Mangel på vekst kjegle formasjon, gjenfødelse, og tap av ytterligere myelinerte aksonale anslag i ryggmargen i stor grad begrenser nevrologisk restitusjon etter skade. For å vurdere hvordan sentrale myelinerte axoner i ryggmargen svare på skade, har vi utviklet en ex vivo lever ryggmarg modell utnytte transgene mus som uttrykker gul fluoriserende protein i axoner og et samlings og svært reproduserbare laser-indusert ryggmargsskade å dokumentere skjebne axoner og myelin (lipofile fluorescerende fargestoff Nile Red) over tid ved hjelp av to-foton eksitasjon time-lapse mikroskopi. Dynamiske prosesser som akutt nerveskaden aksonal tilbaketrekking, og myelin degenerasjon er best studert i sanntid. Imidlertid, den ikke-fokal natur kontusjon baserte skader og bevegelse gjenstander støttunder in vivo ryggmarg bildebehandling make skille primære og sekundære nerveskaden svar gjennom høy oppløsning mikros utfordrende. Ex vivo ryggmarg modellen beskrevet her etterligner flere aspekter av klinisk relevante kontusjon / komprimering-indusert aksonale patologier inkludert aksonal hevelse, spheroid formasjon, aksonal tran, og peri-aksonal hevelse som gir en nyttig modell for å studere disse dynamiske prosesser i sanntid. Store fordelene med denne modellen er utmerket spatiotemporal oppløsning som tillater differensiering mellom primær fornærmelse som direkte skader axoner og sekundære skademekanismer; kontrollert infusjon av reagenser direkte til perfusatet bading ledningen; presise endringer av miljø miljøet (for eksempel kalsium, natrium ioner, kjente bidragsytere til aksonal skade, men i nærheten umulig å manipulere in vivo); og murine modeller har også en fordel, da de gir en mulighet til å visualisere ogmanipulere genetisk identifisert celle populasjoner og subcellulære strukturer. Her beskriver vi hvordan du isolerer og bilde levende ryggmargen fra mus til å fange dynamikken i akutt nerveskaden.

Introduction

Degenerasjon av aksoner er en fremtredende årsak til sykelighet spenner over flere nevrologiske tilstander inkludert neurotrauma, hjerneslag, autoimmune, og nevrodegenerative sykdommer. I motsetning til det perifere nervesystem (PNS), sentralnervesystem (CNS) aksoner har en begrenset kapasitet til å regenerere en gang skadet på grunn av både indre og ytre barrierer (dvs. inhibitoriske molekyler til aksonal vekst produseres under arrdannelse og frigjøres under myelin degenerasjon) ^{1 -7.} Selv om flere av disse barrierene har blitt grundig utforsket, til terapeutiske intervensjoner rettet forhindre CNS aksonal degenerasjon, fremme robust aksonal gjenfødelse og gjenopprette funksjonelle connectively, forbli begrenset.

Aksoner gang separert fra sin soma gjennomgå en stereotype prosessen med degenerasjon kjent som Wallerian degenerasjon som er preget av aksonal hevelse, spheroid dannelse og eventuell fragmentering (anmeldt i ^8). IDerimot den proksimale stubbe som forblir i kontinuitet med soma av en transektert perifer axon, danner en hevelse ved sin ende, dør tilbake til den nærmeste noden Ranvier, og kan så initiere veksten kjegle formasjonen, en viktig forutsetning er nødvendig for etterfølgende aksonal regenerering ^9-11. I kontrast til de proksimale aksonale avslutninger av mange sentrale aksoner danner karakteristiske «endbulbs" eller tilbaketrekk pærer, ikke klarer å danne vekst kjegler, og i stedet trekke bort fra skadestedet hvor de forblir i månedsvis etter skade ^12-15. I tillegg til den primære nerveskaden kan ytterligere aksonal skade / tap også skje til axoner som ble stort sett forskånet fra den første skade. Dette forsinket aksonal tap av opprinnelig spart aksoner er referert til som sekundære aksonal degenerasjon. Denne iboende respons på CNS axoner til skade gjengir funksjonell aksonal regenerasjon en enda vanskeligere mål å oppnå i hjernen og ryggmargen.

Selv hallmarks av aksonal skade (for eksempel, spheroid formasjon, inntrekk av pærer) har blitt godt preget av post-mortem vev og eksperimentelle modeller av aksonal degenerasjon, har klarlegging av de molekylære mekanismene bak disse dynamiske prosesser vært begrenset. De fleste av disse studiene støttet seg på statiske endepunkt observasjoner som iboende ikke klarte å fange opp individuelle aksonale svar over tid. Selv om eksogent tilført aksonale sporstoffer har vært nyttig å belyse aksonale svar fra statiske seksjoner og under live bildebehandling, har tilgjengeligheten av genetisk kodet aksonale markører kraftig forbedret vår evne til å visualisere axoner i sanntid ved hjelp av fluorescens mikroskopi. Faktisk, en banebrytende rapport fra Kerschensteiner og kolleger først gitt direkte bevis på aksonal degenerasjon og regenerasjon in vivo ved hjelp Thy1 -GFP-S mus som koder grønt fluorescerende protein i undergrupper av nevroner som sender sine anslag i ryggsøyler i ryggledningen ^16. Live-avbildning tilnærminger bruker to foton laserskanning mikroskopi (TPLSM) og genetisk fluorescerende protein merking av celler av interesse fortsetter å gi direkte bevis og mekanistisk innsikt i mange ulike dynamiske prosesser som aksonal degenerasjon, Ca ²⁺ signalering, aksonal regenerasjon, astrocyte fysiologi, microglial fysiologi, og respons på skade ^17-25.

I motsetning til axoner, er svært lite kjent av myelin svar til skade i sanntid. Myelin er en viktig komponent i hvit substans produsert og vedlikeholdt av oligodendrocytter i CNS og Schwann celler i PNS. Myelin isolerer 99% av overflaten av axoner og dermed gir en høy motstand, lav kapasitans beskyttende dekke som støtter rask og effektiv saltatory impuls forplantning, nylig gjennomgått av butter et al. ^26. For å fange den dynamiske responsen av myelin til skade vi bruker solvatochromic, lipofilefluorescerende fargestoff Nile Red ^27. De solvatochromic egenskaper av denne viktige flekken tillate spektrale endringer av dens emisjonsspektrum som er avhengig av fysikalsk-kjemiske miljøet ^28,29. Disse egenskapene er nyttig å få innsikt i mekanismene for axomyelinic skade og kan visualiseres ved hjelp av riktig utvalgte dichroics og emisjonsfiltre eller løses ved hjelp av spektral mikros ^27. For eksempel er Nile Red største emisjonsspektrum blå forskjøvet i mindre polare, fettrike miljøer så som de som finnes i adipocytter og normal CNS myelin (topp emisjons ~ 580-590 nm) ^27. I kontrast til dette viktige fargestoff utslipp spektrum topper på ~ 625 nm i endbulbs dannet som axoner gjennomgå aksonal dieback ^27. Selv om de nøyaktige mekanismene bak disse spektrale skift spesielt i endbulbs versus normal myelin fortsatt uklare, kan slike spektrale endringer avsløre underliggende endringer i protein opphopning eller uorden fører tileksponering av hydrofobe bindingsseter ^27.

Mens in vivo avbildning er det ultimate målet for å observere ryggmargs aksonal skade dynamikk i sitt opprinnelige miljø, er det teknisk utfordrende og krever betydelig kirurgisk kompetanse, og ofte gjenta operasjoner for å eksponere rygg kolonne som kan introdusere eksperimentelle artefakter (f.eks betennelse og arr Formasjonen). I tillegg er kostbart utstyr ofte nødvendig for å tillate fjæring og posisjonering av et intakt dyr under mikroskop objektivlinse. Dyrene må overvåkes nøye i tillegg til å sikre at de forblir varm, for å sikre væsker er fylt opp, og for å sikre at det ikke er noen tegn til hypoksi på grunn av langvarig bedøvet bilde økter. Sistnevnte er ekstremt viktig som axoner og myelin krever absolutt konstant perfusjon og tilstrekkelig oksygennivå for å være levedyktig. Imidlertid er dette ofte ikke rapportert eller overvåkes i de fleste in vivo studier for ådato. I tillegg bevegelse gjenstander på grunn av hjertefrekvens og pust (isofluran bedøvet voksen mus: ~ 300-450 slag pr min (BPM) er optimalt å opprettholde 97-98% oksygenmetning (normal hastighet ~ 632 BPM) og ~ 55-65 åndedrag per min (normal hastighet er ~ 163 pust per min), henholdsvis)) ³⁰ påtruffet under in vivo ryggmarg bildebehandling make skille primære og sekundære nerveskaden svar gjennom høy oppløsning fluorescens mikros utfordrende så selv de raskeste laserskanning uunngåelig er underlagt disse bevegelse artefakter. Fremskritt i superraske resonans skannere kombinert med en implanterbar stivt ryggvirvel innrammet vinduet kan tillate avbildning av den murine ryggmargen i våkne dyr, men raskere skanne ganger uunngåelig reduserer signal-til-støy-forholdet degraderende bildekvalitet. Ytterligere forbedringer i ryggmargen avbildningsteknikker som i dag brukes for avbildning av hjernen kan overvinne mange av disse hindringene og begrense potensielle confounds introdusert av inadequate vevsperfusjon, f.eks ^31-33.

Mye av det som er kjent om hvit substans fysiologi og mekanismer for hvit substans skade er fastsatt ved bruk in vitro eller ex vivo preparater av hvit substans fra synsnerven, perifer nerve, og strimler av ryggmarg hvit substans ^34-41. Disse forberedelsene fortsette å fremme vår kunnskap om hvite materie skademekanismer som de tillater kontrollert endringer i miljøfaktorer, kontrollert anvendelse av narkotika og reagenser, funksjonelle vurderinger som bruker elektrofysiologi, og direkte fluorescens mikros observasjoner av axoner og myelin i levende vev. Likevel, til noen tidligere tilnærminger observere axoner fra ryggmarg ryggkolonne strimler eller ventral hvit substans strimler uunngåelig skade overflate axoner under fjerningen scene som kan påvirke responsen av nært motsetning aksoner. Å kapitalisere på de eksperimentelle manipulasjoner over og unngå skade på very fibrene under etterforskning, bruker vi en ex vivo cervical ryggmargs modell som det hindrer direkte kontakt med dorsal del av ledningen. Dermed arkitektur av pia mater og tilstøtende overfladisk ryggkolonne axoner forbli levedyktig og uaffisert under isolasjon.

Her beskriver vi en relativt enkel tilnærming som tillater direkte visualisering av sentrale myelinerte axoner som de dynamisk svare på et fokus skade i sanntid opp til 8 – 10+ timer etter skade. Laser-indusert ryggmargsskade (Lisci) modellen tillater differensiering mellom primære og sekundære aksonal skademekanismer som primær lesjon (ablasjon stedet) forblir romlig begrenset over tid. Den åpne bad bildekammeret er tilgjengelig for terapeutisk intervensjon, reagent levering, og miljø manipulasjoner. Antatte axomyelinic beskyttende agenter kan raskt vurderes i sanntid ved direkte observasjoner versus lange og kostbare eksperimenter som involverer vev prosessing, seksjonering, farging, bildeopptak, og analyse og derfor gir en nyttig surrogat modell for å vurdere akutte reaksjoner og beskyttende manipulasjoner før du tester de eksperimentelle agenter i levende dyr.

Protocol

MERK: Alle dyr prosedyrer ble utført under retningslinjer fastsatt av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Louisville, å følge føderale forskrifter. 1. Utarbeidelse av lav Ca 2+ og 2 mM Ca 2+ Kunstig cerebrospinalvæsken (aCSF) Perfusates Forberede 2x lav Ca 2+ (0,1 mm) Stock C buffer, 2x normal Ca 2+ (2 mm) Stock En buffer, og 2x Stock B buffer som beskrevet i tabell 1. De individuelle …

Representative Results

Detaljer av en egnet laboratorium satt opp for å isolere, opprettholde levedyktighet og bilde ex vivo ryggmargen er vist i figur 1. Mikroskopet må være utstyrt med en fleksibel femtosecond pulset laser, egnede dicroics og emisjonsfiltre, og en vann- dyppe objektiv med høy numerisk apertur (≥1.0). For å sikre levedyktighet av ryggmargen i løpet av disseksjon, bør fremgangsmåten utføres i nærvær av kjølt oksygenert lav Ca2 + aCSF som tillater nok Ca2 + for de i…

Discussion

Vi beskriver en fremgangsmåte for avbildning ex vivo ryggmargs myelinerte axoner (dvs. gracile fasciculus) i kombinasjon med en laser-indusert ryggmargsskade for å studere den dynamiske progresjon av både primær og sekundær myelinated aksonal degenerasjon over tid. Ex vivo avbildning av overflaten ryggmargen vinner mange av komplikasjoner forbundet med in vivo avbildning slik som bevegelsesartefakter og potensialet av eksperimentator-indusert hypoksi under lengre bilde økter. De…

Materials

Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Large bath chamber with slice supports	Warner Instruments	RC-27L	For ex vivo imaging chamber
Standard Slice Supports	Warner Instruments	SS-3	For ex vivo imaging chamber
Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers	Warner Instruments	SHD-27LP/10	For ex vivo imaging chamber
Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed	Warner Instruments	ST-1L	For ex vivo imaging chamber
Solution In-line heater/cooler	Warner Instruments	SC-20	To regulate perfusate temperature during imaging
Bipolar temperature controller	Warner Instruments	CL-100	To regulate perfusate temperature during imaging
Liquid Cooling System	Warner Instruments	LCS-1	To regulate perfusate temperature during imaging
Cable assembly for heater controllers	Warner Instruments	CC-28	To regulate perfusate temperature during imaging
Replacement bead thermisitor for CC-28 cable	Warner Instruments	TS-70B	To regulate perfusate temperature during imaging
Magnetic holder with suction tubing	Bioscience Tools	MTH-S	To hold the stainless steel vacuum suction tubing
Adjustable holder	Bioscience Tools	MTH	To hold the temperature probe
clear silicone sealant			For ex vivo imaging chamber
superglue			For ex vivo imaging chamber
thin plexiglass strips			For ex vivo imaging chamber
nile red	Life Technologies	N-1142	For labeling myelin