En<em> Ex vivo</em> Laser-induceret Rygmarvsskader model til opgørelse Mekanismer axon Degeneration i realtid

Summary

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Abstract

Skadede CNS axoner undlader at regenerere og ofte trække væk fra skadestedet. Axoner skånet fra den oprindelige skade, kan senere gennemgå sekundær axonal degeneration. Mangel på vækst kegle formation, regeneration, og tab af yderligere myelinerede axonale projektioner i rygmarven i høj grad begrænser neurologisk restitution efter skade. At vurdere, hvordan centrale myelinerede axoner i rygmarven svare til skade, har vi udviklet en ex vivo levende rygmarv model anvender transgene mus, der udtrykker gult fluorescerende protein i axoner og et samlingspunkt og meget reproducerbar laserinduceret rygmarvsskade at dokumentere skæbne axoner og myelin (lipofile fluorescerende farvestof Nile rød) over tid ved hjælp af to-foton excitation time-lapse mikroskopi. Dynamiske processer, såsom akut axonal skade axonal tilbagetrækning, og myelin degeneration bedst undersøgt i realtid. Men den ikke-prioriteret natur kontusion baserede skader og bevægelse artefakter stødtunder in vivo rygmarven imaging make differentiere primære og sekundære axonale skade respons ved hjælp af høj opløsning mikroskopi udfordrende. Den ex vivo rygmarv model her beskrevne efterligner flere aspekter af klinisk relevante kontusion / komprimering-induceret axonale patologier, herunder axonal hævelse, kugleformet dannelse, axonal transektion og peri-aksonal hævelse giver en nyttig model til at studere disse dynamiske processer i real-tid. Store fordele ved denne model er fremragende spatiotemporale opløsning, der tillader differentiering mellem den primære fornærmelse, der direkte skader axoner og sekundære skade mekanismer; styret infusion af reagenser direkte til perfusatet badning ledningen; præcise ændringer af miljømæssige miljø (fx calcium, natriumioner, kendte bidragydere til axonal skade, men næsten umuligt at manipulere in vivo); og murine modeller tilbyder også en fordel, da de giver mulighed for at visualisere ogmanipulere genetisk identificerede cellepopulationer og subcellulære strukturer. Her beskriver vi, hvordan at isolere og afbilde levende rygmarven fra mus at fange dynamikken i akut axonal skade.

Introduction

Degeneration af axoner er en fremtrædende årsag til sygelighed spænder adskillige neurologiske tilstande, herunder neurotrauma, slagtilfælde, autoimmune og neurodegenerative sygdomme. I modsætning til det perifere nervesystem (PNS), centralnervesystemet (CNS) axoner har en begrænset evne til at regenerere, når såret på grund af både indre og ydre barrierer (dvs. hæmmende molekyler til axonal vækst produceret under ardannelse og befriet under myelin degeneration) ^{1 -7.} Selv om flere af disse barrierer er blevet grundigt undersøgt, at terapeutiske indgreb rettet forhindre CNS axonal degeneration, fremme robust axonal regenerering og genoprette funktionel connectively, begrænses.

Axoner engang adskilt fra deres soma gennemgå en stereotyp proces med degeneration kaldet Wallerian degeneration, der er præget af axonal hævelse, klumpformet dannelse og eventuel opsplitning (revideret i ^8). IDerimod er proximale stump, der er tilbage i kontinuitet med den soma af en gennemskæres perifer Axon, danner en hævelse ved sin ende, dør tilbage til den nærmeste Ranviersk indsnøring, og kan derefter initiere vækst kegle dannelse, en vital forudsætning nødvendig til efterfølgende axonal regenerering ^9-11. I modsætning hertil proximale axonale endelser mange centrale axoner danner karakteristiske "endbulbs" eller retraktionsindstillingen pærer, undlader at danne vækstkegler, og i stedet trække væk fra skaden site, hvor de forbliver i flere måneder efter skaden ^12-15. Ud over den primære axonal skade, kan yderligere axonal skade / tab også forekomme for axoner, der blev stort set skånet fra den indledende skade. Dette forsinkede axonal tab af oprindeligt sparet axoner omtales som sekundær axonal degeneration. Denne iboende respons af CNS-axoner skade gør funktionel axonal regenerering en endnu vanskeligere mål at opnå i hjernen og rygmarven.

Selvom hallmarks af axonal skade (f.eks kugleformet dannelse, opløft- pærer) er blevet godt karakteriseret af post mortem væv og eksperimentelle modeller for axonal degeneration, har belysning af de molekylære mekanismer bag disse dynamiske processer blevet begrænset. De fleste af disse undersøgelser har påberåbt sig statisk endpoint observationer, i sagens natur ikke har indfange individuelle axonale reaktioner over tid. Selvom eksogent anvendt axonale sporstoffer have været nyttigt at belyse axonale svar fra statiske sektioner og under billeddannelse, er adgangen til genetisk indkodede axonale markører stærkt forbedret vores evne til at visualisere axoner i realtid ved hjælp af fluorescens mikroskopi. Faktisk en skelsættende rapport fra Kerschensteiner og kolleger først forudsat direkte bevis for axonal degeneration og regeneration in vivo ved hjælp Thy1 -GFP-S-mus, der koder for grønt fluorescerende protein i undergrupper af neuroner, der sender deres fremskrivninger i den dorsale kolonner i spinalledning ^16. Live-billedteknik ved hjælp af to foton laser scanning mikroskopi (TPLSM) og genetisk fluorescerende protein mærkning af celler af interesse fortsætter med at yde direkte bevis og mekanistisk indsigt i mange forskellige dynamiske processer som axonal degeneration, Ca2 ⁺ signalering, axonal regenerering, astrocyt fysiologi, mikroglial fysiologi, og respons på skade ^17-25.

I modsætning til axoner, er meget lidt kendt af myelin reaktioner på skade i real-tid. Myelin er en vital del af hvid substans, der produceres og vedligeholdes af oligodendrocytter i CNS og Schwann celler i PNS. Myelin isolerer 99% af overfladen af axoner og derved giver en høj modstand, lav kapacitans beskyttende beklædning, der understøtter hurtig og effektiv saltatory impuls formering, for nylig revideret af Buttermore et al. ^26. For at fange den dynamiske respons af myelin til skade, vi bruger solvatochromic, lipofilefluorescerende farvestof Nile Red ^27. De solvatochromic egenskaber af denne vitale plet tillade spektrale skift i dens emissionsspektrum der er afhængig af fysisk-kemiske miljø ^28,29. Disse egenskaber er nyttigt at få indsigt i mekanismerne for axomyelinic skade og kan visualiseres ved hjælp passende udvalgte dichroics og emissionsfiltre eller løses ved hjælp af spektrale mikroskopi ^27. For eksempel, Nile Red emissionsspektrum er blå-forskydes i mindre polære lipid-rige omgivelser, såsom dem, der findes i adipocytter og normal CNS myelin (topemission ~ 580-590 nm) ^27. I modsætning hertil denne vitale farvestof emission spektrum toppe ved ~ 625 nm i endbulbs dannet som axoner gennemgår axonal skovdød ^27. Selv om de præcise mekanismer bag disse spektrale skift specifikt i endbulbs versus normal myelin er fortsat uklare, kan sådanne spektrale ændringer afsløre underliggende ændringer i protein akkumulering eller forvaltningsmæssigt fører tileksponering af hydrofobe bindingssteder ^27.

Mens in vivo imaging er den ultimative metriske til observation rygmarv axonal skade dynamik i deres oprindelige miljø, er det teknisk udfordrende og kræver omfattende kirurgisk ekspertise, og ofte gentage kirurgi for at eksponere den dorsale kolonne, der kan indføre eksperimentelle artefakter (f.eks betændelse og ar dannelse). Desuden er dyrt udstyr ofte påkrævet for at tillade suspension og placering af et intakt dyr under mikroskop objektivlinsen. Dyrene skal nøje overvåges, og at sikre, at de forbliver varm, for at sikre, væsker genopfyldes, og at sikre, at der ikke er tegn på hypoxi på grund af langvarig bedøvede imaging sessioner. Sidstnævnte er yderst vigtigt, da axoner og myelin absolut kræver konstant perfusion og tilstrækkelige iltindhold at forblive levedygtig. Men det er ofte ikke rapporteret eller overvåges i de fleste in vivo studier tildato. Desuden bevægelse artefakter på grund af puls og vejrtrækning (isofluran bedøvet voksen mus: ~ 300-450 slag pr minut (BPM) er optimal til at opretholde 97-98% iltmætning (normale sats ~ 632 BPM) og ~ 55-65 vejrtrækninger per min (normale sats er ~ 163 vejrtrækninger per minut), henholdsvis)) ³⁰ opstod under in vivo rygmarven imaging make differentiere primære og sekundære axonale skade respons ved hjælp af høj opløsning fluorescensmikroskopi udfordrende, da selv de hurtigste laser scanninger uundgåeligt er underlagt disse bevægelser artefakter. Fremskridt i ultrahurtige resonante scannere kombineret med en implanterbar stift vertebral indrammet vindue kan tillade billeddannelse af murine rygmarven i vågne dyr, men hurtigere scan gange uundgåeligt reducere signalet til støjforholdet nedbrydende billedkvalitet. Yderligere forbedringer af rygmarv billeddiagnostiske teknikker som i øjeblikket anvendes til hjernescanning kan overvinde mange af disse hindringer og begrænse potentielle forvirrer indført ved inakeligt vævsperfusion, fx ^31-33.

Meget af det, man ved om hvide substans fysiologi og mekanismer hvid substans skaden er blevet bestemt ved hjælp af in vitro eller ex vivo præparater af hvid substans fra synsnerven, perifer nerve, og strimler af rygmarven hvide substans ^34-41. Disse præparater fortsætte med at fremme vores viden om hvide substans skade mekanismer, da de tillader kontrollerede ændringer i miljøfaktorer, kontrollerede anvendelse af lægemidler og reagenser, funktionelle vurderinger ved hjælp elektrofysiologi, og direkte fluorescens mikroskopi observationer af axoner og myelin i levende væv. Men for nogle tidligere tilgange observere axoner fra rygmarv dorsale kolonne strimler eller mobile hvide substans strimler uundgåeligt skade overflade axoner under fjernelsen fase, kan påvirke respons på nært modstående axoner. For at udnytte de eksperimentelle manipulationer over og undgå skader på veRy fibre, der undersøges, bruger vi en ex vivo cervikal rygmarv model, da det forhindrer direkte kontakt mellem dorsale aspekt af ledningen. Således arkitektur pia mater og tilstødende kolonne axoner overfladisk dorsale forbliver levedygtige og uforstyrret under isolation.

Her beskriver vi en forholdsvis enkel fremgangsmåde, der giver mulighed for direkte visualisering af centrale myelinerede axoner, som de dynamisk reagere på en fokal skade i real-tid op til 8 – 10+ timer efter skaden. Laseren-induceret rygmarvsskade (Lisci) model giver mulighed differentiering mellem primære og sekundære axonal skade mekanismer som den primære læsion (ablation stedet) forbliver rumligt begrænsede over tid. Den åbne bad imaging kammer er tilgængelig for terapeutisk intervention, reagens levering, og miljømæssige manipulationer. Formodede axomyelinic beskyttelsesmidler kan hurtigt vurderes i realtid ved direkte observationer versus langvarige og kostbare forsøg med væv procesING, sektionering, immunfarvning, image capture og analyse og dermed et nyttigt surrogat model til at vurdere akutte reaktioner og beskyttende manipulationer Før testning eksperimentelle stoffer i levende dyr.

Protocol

BEMÆRK: Alle dyreforsøg blev udført under retningslinier fastsat af det institutionelle Animal Care og brug Udvalg ved University of Louisville, overholde føderale bestemmelser. 1. Fremstilling af lav Ca 2+ og 2 mM Ca2 + Kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) perfusater Forbered 2x lav Ca 2+ (0,1 mM) Stock C buffer, 2x normal Ca2 + (2 mM) Stock A buffer, og 2x Stock B-buffer som beskrevet i tabel 1. De individuell…

Representative Results

Detaljer for et passende laboratorium nedsat behov for at isolere, vedligeholde levedygtigheden, og billedet ex vivo rygmarven er vist i figur 1. Mikroskopet skal udstyres med en afstemmelig pulseret femtosekundlaser passende dicroics og emissionsfiltre, og vand- dypning objektiv med en høj numerisk blænde (≥1.0). For at sikre levedygtighed rygmarven under dissektion, bør proceduren udføres i nærværelse af kølet iltet lav Ca 2+ aCSF der giver nok Ca 2+ for de isol…

Discussion

Vi beskriver en fremgangsmåde til billeddannelse ex vivo rygmarv myelinerede axoner (dvs. gracile fasciculus) kombineret med en laser-induceret rygmarvsskade at studere dynamiske progression af både primær og sekundær myelinerede axonal degeneration over tid. Ex vivo-afbildning af overfladen af rygmarven overvinder mange af komplikationer forbundet med in vivo-billeddannelse såsom bevægelsesartefakter og potentialet af forsøgslederen hypoksi under langvarige imaging sessioner. …

Materials

Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Large bath chamber with slice supports	Warner Instruments	RC-27L	For ex vivo imaging chamber
Standard Slice Supports	Warner Instruments	SS-3	For ex vivo imaging chamber
Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers	Warner Instruments	SHD-27LP/10	For ex vivo imaging chamber
Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed	Warner Instruments	ST-1L	For ex vivo imaging chamber
Solution In-line heater/cooler	Warner Instruments	SC-20	To regulate perfusate temperature during imaging
Bipolar temperature controller	Warner Instruments	CL-100	To regulate perfusate temperature during imaging
Liquid Cooling System	Warner Instruments	LCS-1	To regulate perfusate temperature during imaging
Cable assembly for heater controllers	Warner Instruments	CC-28	To regulate perfusate temperature during imaging
Replacement bead thermisitor for CC-28 cable	Warner Instruments	TS-70B	To regulate perfusate temperature during imaging
Magnetic holder with suction tubing	Bioscience Tools	MTH-S	To hold the stainless steel vacuum suction tubing
Adjustable holder	Bioscience Tools	MTH	To hold the temperature probe
clear silicone sealant			For ex vivo imaging chamber
superglue			For ex vivo imaging chamber
thin plexiglass strips			For ex vivo imaging chamber
nile red	Life Technologies	N-1142	For labeling myelin