En<em> Ex vivo</em> Laser-inducerad ryggmärgsskada modell för bedömning Mekanismer axonal degeneration i realtid

Summary

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Abstract

Skadade CNS axoner inte regenerera och ofta dras bort från skadeplatsen. Axoner förskonade från den ursprungliga skadan kan senare genomgå sekundär axonal degeneration. Brist på tillväxt konen bildning, regeneration, och förlust av ytterligare myeliniserade axonal prognoser inom ryggmärgen begränsar kraftigt neurologisk återhämtning efter skada. För att bedöma hur centrala myeliniserade axoner i ryggmärgen svarar på skada, utvecklade vi en ex vivo levande ryggmärgen modell använder transgena möss som uttrycker gula fluorescerande protein i axoner samt en kontaktpunkt och mycket reproducerbar laserinducerad ryggmärgsskada att dokumentera öde axoner och myelin (lipofila fluorescerande färg Nile Red) över tid med hjälp tvåfotonexcitering time-lapse mikroskopi. Dynamiska processer såsom akut axonal skada, axonal retraktion och myelin degenerering bäst studeras i realtid. Emellertid, den icke-fokal karaktär kontusion baserade skador och rörelseartefakter påträffasunder in vivo ryggmärgen avbildning gör differentiera primära och sekundära axonal skada svar via högupplösta mikroskopi utmanande. Den ex vivo ryggmärgen modell som beskrivs här härmar flera aspekter av kliniskt relevanta kontusion / kompressions-inducerad axonal patologier inklusive axonal svullnad, sfäroid formation, axonal transection, och peri-axonal svullnad ger en användbar modell för att studera dessa dynamiska processer i realtid. Stora fördelar med denna modell är utmärkta Spatiotemporal upplösning som tillåter differentiering mellan primär förolämpning som direkt skadar axoner och sekundära skademekanismer; kontrollerad infusion av reagenser direkt till perfusatet bad sladden; exakta förändringar av miljö miljön (t.ex. kalcium, natriumjoner, kända bidragsgivare till axonal skada, men nära omöjligt att manipulera in vivo); och musmodeller erbjuder också en fördel eftersom de ger en möjlighet att visualisera ochmanipulera genetiskt identifierade cellpopulationer och subcellulära strukturer. Här beskriver vi hur du isolera och bild levande ryggmärgen från möss att fånga dynamiken i akut axonal skada.

Introduction

Degeneration av axoner är en framträdande orsak till sjuklighet spänner flera neurologiska tillstånd inklusive neurotrauma, stroke, autoimmuna och neurodegenerativa sjukdomar. Till skillnad från det perifera nervsystemet (PNS), centrala nervsystemet (CNS) axoner har en begränsad förmåga att regenerera en gång skadade på grund av både inre och yttre hinder (dvs hämmande molekyler till axonal tillväxt produceras under ärrbildning och frigörs under myelin degeneration) ^{1 -7.} Även om flera av dessa hinder har genomgått omfattande utforskas, till terapeutiska interventioner som syftar förhindra CNS axonal degeneration, främja robust axonal regeneration, och återställa funktionell connectively, fortfarande begränsade.

Axoner gång separerade från deras soma genomgår en stereotyp urartningsprocess kallas Wallerian degeneration som kännetecknas av axonal svullnad, sfäroid bildning och eventuell fragmentering (översikt i ^8). IDäremot proximala stubbe som finns kvar i kontinuitet med soma av en transected perifer axon, bildar en svullnad vid dess slut, dör tillbaka till närmaste Ranviers nod, och kan sedan initiera tillväxt konen bildning, en viktig förutsättning är nödvändig för efterföljande axonal regeneration ^9-11. Däremot de proximala axonal ändelser av många centrala axoner bildar karakteristiska "endbulbs" eller indragnings lökar, misslyckas med att bilda tillväxt kottar, och istället dra ifrån skada plats där de stannar i månader efter skada ^12-15. Utöver den primära axonal skada, kan ytterligare axonal skada / förlust också uppstå till axoner som till stor del skonades från den ursprungliga skadan. Detta försenade axonal förlust av initialt skonade axoner kallas sekundär axonal degeneration. Denna inneboende respons av CNS axoner till skada gör funktionell axonal regeneration en ännu svårare mål att uppnå i hjärnan och ryggmärgen.

Fastän hektarllmarks av axonal skada (t.ex. sfäroid formation, indragnings glödlampor) har väl karakteriserats från obduktion vävnad och experimentella modeller av axonal degeneration, har belysning av de molekylära mekanismer som ligger bakom dessa dynamiska processer begränsats. De flesta av dessa studier förlitat sig på statiska endpoint observationer som i sig misslyckats med att fånga enskilda axonal svar över tiden. Även exogent tillämpade axonal spårämnen har varit användbara för att belysa axonal svar från statiska sektioner och under live-avbildning, har tillgången på genetiskt kodade axonal markörer förbättrats avsevärt vår förmåga att visualisera axoner i realtid med hjälp av fluorescens mikroskopi. Faktum en sädes- rapport från Kerschensteiner och kollegor först förutsatt direkta bevis för axonal degeneration och regeneration in vivo med hjälp Thy1 -GFP-S möss som kodar grönt fluorescerande protein i delmängder av nervceller som skickar sina prognoser i de dorsala kolumnerna i spinalsladd ^16. Live avbildning med två photon laserskanning mikroskopi (TPLSM) och genetisk fluorescerande proteinet märkning av celler av intresse fortsätter att ge direkta bevis och mekanistisk insikt i många olika dynamiska processer såsom axonal degeneration, Ca2 ⁺ signalering, axonal regeneration, astrocyternas fysiologi, microglial fysiologi, och svar på skada ^17-25.

I motsats till axoner, är mycket lite känt om myelin svar på skada i realtid. Myelin är en viktig del av vit substans som produceras och upprätthålls av oligodendrocyter i CNS och Schwann celler i PNS. Myelin isolerar 99% av ytan av axoner och därigenom ger en hög motståndskraft, låg kapacitans skyddande hölje som stöder en snabb och effektiv saltatorisk impulsutbredning, som nyligen granskats av Buttermore et al. ^26. För att fånga den dynamiska responsen av myelin på skada vi använder solvatochromic, lipofilafluorescerande färgämne Nilrött ^27. De solvatochromic egenskaper denna viktiga fläcken möjliggöra spektrala förskjutningar av dess emissionsspektrum som är beroende av fysikalisk-kemiska miljön ^28,29. Dessa egenskaper är användbara för att få insikt i mekanismer för axomyelinic skada och kan visualiseras med hjälp av lämpligt utvalda dikroiska och utsläppsfilter eller lösas med hjälp av spektral mikroskopi ^27. Till exempel är Nile Reds emissionsspektrum blå-skiftat i mindre polära, lipid rika miljöer såsom de som finns i adipocyter och normal CNS myelin (peak emission ~ 580-590 nm) ^27. Däremot denna vitala färgämnet s utsläppsspektrumtoppar vid ~ 625 nm i endbulbs formade som axoner genomgår axonal skogsskador ^27. Även om de exakta mekanismerna bakom dessa spektrala skift specifikt i endbulbs kontra normal myelin fortfarande oklara, kan sådana spektrala förändringar avslöja underliggande förändringar i protein ackumulering eller desorganisation som leder tillexponering av hydrofoba bindningsställen ^27.

Medan in vivo imaging är den ultimata måttet för att observera ryggmärg axonal skada dynamiken i sin ursprungliga miljö, är det tekniskt utmanande och kräver betydande kirurgisk expertis, och ofta upprepar operationer för att exponera den dorsala kolumnen som kan introducera experimentella artefakter (t.ex. inflammation och ärr bildning). Dessutom behövs ofta kostsam utrustning för att möjliggöra suspension och positionering av ett intakt djur under mikroskop objektivlins. Djuren måste noga övervakas samt att se till att de förblir varma, för att säkerställa vätskor fylls, och för att se till att det inte finns några tecken på hypoxi på grund av långvarig sövda avbildning sessioner. Det senare är mycket viktigt eftersom axoner och myelin kräver absolut konstant perfusion och tillräckliga syrenivåer att förbli livskraftig. Detta är dock ofta inte rapporteras eller övervakas i de flesta in vivo-studier tilldatum. Dessutom rörelse artefakter pga puls och andning (isofluran sövda vuxen mus: ~ 300-450 slag per minut (BPM) är optimalt att hålla 97-98% syremättnad (normal hastighet ~ 632 BPM) och ~ 55-65 andetag per minut (normala skattesatsen är ~ 163 andetag per minut), respektive)) ³⁰ påträffas under in vivo ryggmärgen avbildning gör differentiera primära och sekundära axonal skada svar använder hög upplösning fluorescensmikroskopi utmanande eftersom även de snabbaste laserskanningar oundvikligen är föremål för dessa rörelser artefakter. Framsteg inom ultrasnabba resonans skannrar kombination med en implanterbar styv vertebrala inramade fönster kan tillåta avbildning av den murina ryggmärgen i vakna djur, men snabbare avsökningstider minskar oundvikligen det signalbrusförhållandet nedbrytande bildkvalitet. Ytterligare förbättringar i ryggmärgsavbildningstekniker som för närvarande används för hjärnavbildning kan övervinna många av dessa hinder och begränsa potentiella blandar ihop införts av inadequate vävnadsperfusion, t.ex. ^31-33.

Mycket av vad som är känt om vita substansen fysiologi och mekanismer för vit substans skada har fastställts med hjälp av in vitro eller ex vivo beredningar av vit substans från synnerven, perifer nerv, och remsor av ryggmärgen vit substans ^34-41. Dessa preparat fortsätter att avancera vår kunskap om vita mekanismer materia skade eftersom de möjliggör kontrollerade förändringar i miljöfaktorer, kontrollerad tillämpning av droger och reagenser, funktionella bedömningar som använder elektrofysiologi, och direkta fluorescensmikroskopi observationer av axoner och myelin i levande vävnad. Men att vissa tidigare metoder observera axoner från ryggmärgs dorsala kolonnremsor eller passagerar vita substans remsor oundvikligen skada ytan axoner under avlägsnandet skedet som kan påverka svaret på nära motsatta axoner. För att tillvarata de experimentella manipulationer ovan och undvika skador på very fibrer under utredning, använder vi en ex vivo cervikal ryggmärgsmodellen eftersom den förhindrar direkt kontakt med rygg aspekten av sladden. Således arkitekturen i pia mater och angränsande ytliga dorsala kolonn axoner förbli livskraftig och oberörd under isoleringen.

Här beskriver vi en relativt enkel metod som möjliggör direkt visualisering av centrala myeliniserade axoner som de dynamiskt svara på en fokal skada i realtid på upp till 8 – 10+ timmar efter skada. Den laserinducerad ryggmärgsskada (Lisci) modellen möjliggör differentiering mellan primära och sekundära axonal skademekanismer som den primära lesionen (ablation plats) förblir spatialt begränsade tiden. Den öppna badet avbildning kammare är tillgänglig för terapeutisk intervention, reagensleverans, och miljö manipulationer. Förmodade axomyelinic skyddande medel kan snabbt utvärderas i realtid genom direkta observationer kontra långa och kostsamma experiment med vävnadsprocessning, sektione, immunfärgning, bildfångst, och analys och ger därför en användbar surrogat modell för att bedöma akuta reaktioner och skydds manipulationer innan du testar de experimentella agenter med levande djur.

Protocol

OBS: Alla djurförsök utfördes under riktlinjer som fastställts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Louisville, ansluter sig till federala bestämmelser. 1. Beredning av låg Ca 2 + och 2 mM Ca2 + artificiell cerebrospinalvätska (aCSF) Perfusates Förbered 2x låg Ca2 + (0,1 mM) Lager C-buffert, 2x normala Ca 2 + (2 mM) Lager En buffert och 2x Lager B-buffert som beskrivs i tabell …

Representative Results

Uppgifter om en lämpligt laboratorium inrättades behövs för att isolera, upprätthålla lönsamheten, och bild ex vivo ryggmärgen visas i figur 1. Mikroskopet måste vara utrustad med en avstämbar pulsad femtosecond laser, lämpliga dicroics och utsläppsfilter, och ett vatten- doppa objektiv med hög numerisk apertur (≥1.0). För att säkerställa lönsamheten av ryggmärgen under dissektion, bör förfarandet utföras i närvaro av kylda syresatt låg Ca 2 + aCSF som gör n…

Discussion

Vi beskriver en metod för avbildning ex vivo ryggmärg myeliniserade axoner (dvs smäckert fasciculus) kombinerad med en laserinducerad ryggmärgsskada för att studera den dynamiska progression av både primär och sekundär myeliniserade axonal degeneration över tiden. Ex vivo-avbildning av ytan av ryggmärgen vinner många av de komplikationer i samband med in vivo imaging, såsom rörelseartefakter och potentialen i försöks-inducerad hypoxi vid längre avbildning sessioner. De…

Materials

Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Large bath chamber with slice supports	Warner Instruments	RC-27L	For ex vivo imaging chamber
Standard Slice Supports	Warner Instruments	SS-3	For ex vivo imaging chamber
Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers	Warner Instruments	SHD-27LP/10	For ex vivo imaging chamber
Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed	Warner Instruments	ST-1L	For ex vivo imaging chamber
Solution In-line heater/cooler	Warner Instruments	SC-20	To regulate perfusate temperature during imaging
Bipolar temperature controller	Warner Instruments	CL-100	To regulate perfusate temperature during imaging
Liquid Cooling System	Warner Instruments	LCS-1	To regulate perfusate temperature during imaging
Cable assembly for heater controllers	Warner Instruments	CC-28	To regulate perfusate temperature during imaging
Replacement bead thermisitor for CC-28 cable	Warner Instruments	TS-70B	To regulate perfusate temperature during imaging
Magnetic holder with suction tubing	Bioscience Tools	MTH-S	To hold the stainless steel vacuum suction tubing
Adjustable holder	Bioscience Tools	MTH	To hold the temperature probe
clear silicone sealant			For ex vivo imaging chamber
superglue			For ex vivo imaging chamber
thin plexiglass strips			For ex vivo imaging chamber
nile red	Life Technologies	N-1142	For labeling myelin