Producción y Uso de lentivirus de células selectivamente la transducción primaria Oligodendrocyte precursor para<em> In Vitro</em> Ensayos de mielinización
Summary
Here we present protocols that offer a flexible and strategic foundation for virally manipulating oligodendrocyte precursor cells to overexpress proteins of interest in order to specifically interrogate their role in oligodendrocytes via the in vitro model of central nervous system myelination.
Abstract
La mielinización es un proceso complejo que implica tanto a las neuronas y las células gliales que forman la mielina, oligodendrocitos en el sistema nervioso central (CNS) y células de Schwann en el sistema nervioso periférico (SNP). Utilizamos un ensayo in vitro en la mielinización, un modelo establecido para el estudio de la mielinización del SNC in vitro. Para ello, se añaden las células precursoras de oligodendrocitos (OPC) a las neuronas purificados dorsal roedor ganglio de la raíz primaria (GRD) para formar co-cultivos myelinating. Con el fin de interrogar específicamente el papel que determinadas proteínas expresadas por los oligodendrocitos ejercen sobre la mielinización hemos desarrollado protocolos que transducen selectivamente OPC utilizando el lentivirus sobreexpresan tipo salvaje, proteínas negativas constitutivamente activos o dominantes antes de ser sembradas en las neuronas DRG. Esto nos permite interrogar específicamente las funciones de estas proteínas oligodendrogliales en la regulación de la mielinización. Los protocolos también pueden aplicarse en el estudio de otsus tipos de células, proporcionando de este modo un enfoque que permite la manipulación selectiva de las proteínas expresadas por un tipo de célula deseada, tales como los oligodendrocitos para el estudio selectivo de señalización y mecanismos de compensación. En conclusión, la combinación de la mielinización ensayo in vitro con los OPC lentiviral infección proporciona una herramienta estratégica para el análisis de los mecanismos moleculares implicados en la mielinización.
Introduction
La mielinización de los axones es crucial para la transmisión rápida y eficaz de los potenciales de acción en los sistemas nerviosos central y periférico. Las células especializadas, las células de Schwann en el sistema nervioso periférico y los oligodendrocitos en el sistema nervioso central, y se envuelven alrededor de los axones en ensheathe mielina, aislantes efectivamente el nervio y que facilitan la conducción saltatoria 1. El proceso de mielinización puede ser estudiada in vitro usando las neuronas ganglionares de la retina 2, nanofibras de ingeniería 3, o neuronas ganglionares de la raíz dorsal co-cultivadas con células de Schwann o 4 oligodendrocitos 5-7. El ensayo de mielinización in vitro es un modelo establecido para el estudio de la mielinización del sistema nervioso y se replica muchos de los procesos fundamentales que ocurren durante la mielinización in vivo 5-8. El ensayo consiste en la co-cultivo de las poblaciones purificadas de Ganglio de raíz dorsal (GRD) neuronas, con los OPC (para CNS mielinización) o células de Schwann (por PNS mielinización). En condiciones específicas de estas células mielinizantes ensheathe axones DRG en la ordenada y ultra verificado estructuralmente, hoja multi-lamelar de aislante membrana plasmática que expresan el mismo complemento de proteínas específicas de mielina presentes in vivo.
El modelo de célula más comúnmente utilizado de estudiar la mielinización del SNC in vitro es el co-cultivos de neuronas DRG y OPC, que han sido utilizados con éxito para estudiar el efecto que los factores exógenos tales como las neurotrofinas ejercen sobre la mielinización del SNC in vitro 5,6. Los factores exógenos tales como factores de crecimiento o inhibidores farmacológicos de moléculas pequeñas se han utilizado ampliamente para estudiar el papel de vías de señalización en la mielinización utilizando el DRG-OPC modelo de cocultivo 7,9. Sin embargo, en la configuración de co-cultivo mixto que contienen tanto las neuronas y oligodendrocitos, se mantuvo formalmente posible que cualquiera de los factores de crecimiento o la pharinhibidores macológico podrían haber ejercido efectos en tanto las neuronas y oligodendrocitos (OL) DRG. Este sí ofrece la capacidad de diseccionar específicamente las funciones que las proteínas expresadas únicamente por GRD o oligodendroglia ejerce sobre la mielinización utilizando este sistema celular dual. Para confirmar inequívocamente que la vía de señalización en oligodendroglial regula directamente la mielinización, la transducción lentiviral de OPC, antes de sembrar en las neuronas DRG para el ensayo de mielinización in vitro, ha demostrado ser una manera elegante de sobreexpresan tanto de tipo salvaje y las proteínas mutantes, así como expresión desmontables de proteínas constitutivamente expresadas por los oligodendrocitos. Así, este enfoque ofrece una vía para interrogar y manipular las vías de señalización dentro de los oligodendrocitos para el estudio de la mielinización 9,10 específicamente.
En este artículo analizamos los métodos que hemos desarrollado para sobreexpresan una proteína de interés de forma selectiva en los oligodendrocitos a través de un lentiviralenfoque para el estudio de la mielinización in vitro. La técnica comienza con la generación de vectores de expresión que contienen el gen de interés, ya sea en un tipo salvaje, forma negativa constitutivamente activa o dominante que luego se clonó posteriormente en el vector pENTR (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP). Este vector (que contiene el gen de interés), el donante promotor CMV (pENTR L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV) y el lentivector 2K7 se combinan en una reacción enzimática para producir un vector que contiene el promotor CMV 2K7, el gen de interés, una sitio interno de entrada ribosomal y las buenas prácticas agrarias (Figura 1). Este constructo clonado 2K7 puerta de enlace combinada con la envoltura del virus PMD2.G y el paquete de virus pBR8.91 se puede co-transfectadas en células HEK293T para generar lentivirus que posteriormente se puede usar para transducir OPC. Una vez infectado con el lentivirus los OPCs expresan un alto nivel de la proteína de interés. Estos OPC pueden ser sembradas en cultivos de neuronas DRG y el efecto que la expresiónde altos niveles de la proteína deseada ejerce sobre la mielinización puede ser interrogado. Los co-cultivos se evaluaron para la expresión de proteínas de mielina por análisis de transferencia Western y se visualizaron para la formación de segmentos axonales mielinizadas por inmunocitoquímica.
Protocol
Representative Results
Discussion
La mielinización de los axones es un proceso crucial para la función óptima de los sistemas nerviosos central y periférico de vertebrados. La generación y el mantenimiento de los axones mielinizados es un proceso complejo y coordinado de las interacciones moleculares entre neuronal, glial (a partir de células de Schwann o oligodendrocitos) y proteínas de la matriz extracelular. La importancia y la aplicabilidad de este protocolo es que permite la manipulación de las proteínas en un tipo celular específico dent…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC fellowship #454330 to JX, project grant #628761 to SM and APP1058647 to JX), Multiple Sclerosis Research Australia (MSRA #12070 to JX), the University of Melbourne Research Grant Support Scheme and Melbourne Research CI Fellowship to JX as well as Australia Postgraduate Scholarships to HP and AF. We would like to acknowledge the Operational Infrastructure Scheme of the Department of Innovation, Industry and Regional Development, Victoria Australia.
Materials
| Item | Manufacturer | Catalog # | Notes |
| 2K7 lentivector | Kind gift from Dr Suter9 | ||
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503-100mg | |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115545205 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A11012 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518-5G | |
| B27 – NeuroCul SM1 Neuronal Supplement | Stem Cell Technologies | 5711 | |
| BDNF (Human) | Peprotech | PT450021000 | |
| Biotin (d-Biotin) | Sigma Aldrich | B4639 | |
| Bradford Reagent | Sigma Aldrich | B6916-500ML | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4161 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-100G | |
| CNTF | Peprotech | 450-13020 | |
| DAKO fluoresence mounting media | DAKO | S302380-2 | |
| DMEM, High Glucose, Pyruvate, no Glutamine | Life Technologies | 10313039 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-375KU | |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Life Technologies | 14040182 | |
| EBSS | Life Technologies | 14155063 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101 | |
| Entry vectors for promoter and gene of interest | Generate as per protocols 1-2 | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12003C | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886-50MG | |
| Glucose (D-glucose) | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Glycerol | Chem Supply | GL010-500M | See stock solutions |
| Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115005003 | |
| Goat Anti-Mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115005020 | |
| Goat Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | 112005167 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Igepal | Sigma Aldrich | I3021-100ML | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I6634 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Laminin | Life Technologies | 23017015 | |
| LB Medium | See stock solutions | ||
| LB-Agar | See stock solutions | ||
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | C-7477 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Life Technologies | 11415064 | |
| L-Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| L-Glutamine- 200mM (100X) liquid | Life Technologies | 25030081 | |
| LR Clonase II Plus enzyme | Life Technologies | 12538-120 | |
| MEM, NEAA, no Glutamine | Life Technologies | 10370088 | |
| Mouse α βIII Tubulin | Promega | G7121 | |
| Mouse αMBP (monoclonal) | Millipore | MAB381 | |
| Na pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| NAC | Sigma Aldrich | A8199 | |
| NcoI-HF | NEB | R3193S | |
| NEBuffer 4 | NEB | B7004S | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| NGF (mouse) | Alomone Labs | N-100 | |
| NT-3 | Peprotech | 450-03 | |
| O1 antibody – Mouse anti-O1 | Millipore | MAB344 | Alternative if O1 hybridoma cells are unavailable |
| O1 hybridoma cells | Conditioned medium containing anti-O1 antibody to be used for immunopanning | ||
| O4 antibody – Mouse anti-O4 | Millipore | MAB345 | Alternative if O4 hybridoma cells are unavailable |
| O4 hybridoma cells | Conditioned medium containing anti-O4 antibody to be used for immunopanning | ||
| Competent Cells | Life Technologies | A10460 | |
| One Shot Stbl competent cells | Life Technologies | C7373-03 | |
| Papain Suspension | Worthington/Cooper | LS003126 | |
| pBR8.91 | Kind gift from Dr Denham10 | ||
| PDGF-AA (Human) | Peprotech | PT10013A500 | |
| Penicillin- Streptomycin 100X solution | Life Technologies | 15140122 | |
| pENTRY4IRES2GFP | Invitrogen | 11818-010 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727-100ML | |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | |
| Protease inhibitor tablet (Complete mini) | Roche | 11836153001 | |
| Proteinase K | Supplied with Clonase enzyme | ||
| Putrescine | Sigma Aldrich | P-5780 | |
| Rabbit α neurofilament | Millipore | AB1987 | |
| Rabbit αMBP (polyclonal) | Millipore | AB980 | |
| Ran2 hybridoma cells | ATCC | TIB-119 | Conditioned medium containing anti-Ran2 antibody to be used for immunopanning |
| Rat anti CD140A/PDGFRa antibody | BD Pharmingen | 558774 | |
| SacII | NEB | R0157 | |
| SOC medium | Supplied with competent bacteria | ||
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261 | |
| Spe I | NEB | R0133S | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Buffer | NEB | B0202S | |
| TE buffer pH8 | See stock solutions | ||
| TNE lysis buffer | |||
| Trace Elements B | Cellgro | 99-175-CI | |
| Transferrin (apo-Transferrin human) | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9201-1G | |
| Trypsin Inhibitor From Chicken Egg White | Roche | 10109878001 | |
| Trypsin-EDTA (1X), phenol red (0.05%) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Unconjugated Griffonia Simplicifolia Lectin BSL-1 | Vector laboratories | L-1100 | |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003-5G |
References
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