Kirurgisk Metod för viralt medierad Gene Leverans till musen innerörat genom det runda fönstret Membrane

Summary

The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane.

Abstract

Genterapi, som används för att uppnå funktionell återhämtning från sensorineural dövhet, lovar lämna bättre förståelse av de bakomliggande molekylära och genetiska mekanismer som bidrar till hörselnedsättning. Införande av vektorer in i innerörat måste göras på ett sätt som har brett distribuerar medlet i snäckan och samtidigt minimera skador på de befintliga strukturerna. Detta manuskript beskriver en post-aurikulär kirurgisk metod som kan användas för mus cochlea terapi med användning av molekylära, farmakologisk och viral leverans till möss postnatal dag 10 och äldre via runda fönstermembranet (RWM). Denna kirurgisk metod möjliggör snabb och direkt leverans till scala tympani samtidigt minimera blodförlust och undvika djurdödligheten. Denna teknik innebär försumbar eller ingen skada på viktiga strukturer i inner och mellanörat samt nackmusklerna samtidigt helt bevara hörseln. För att demonstrera effekten av detta kirurgisk teknik, den vesikulära glutamåt transportör 3 knockout (VGLUT3 KO) möss kommer att användas som ett exempel på en musmodell av kongenital dövhet som återvinner höra efter leverans av VGLUT3 till innerörat med hjälp av en adeno-associerat virus (AAV-1).

Introduction

Genterapi har länge föreslagits som en potentiell behandling för genetisk hörselnedsättning, men framgång inom detta område har varit svårfångade ^1. Hittills har viralt medierade metoder dominerade grund den teoretiska möjligheten att rikta specifika celltyper inom den relativt otillgängliga snäckan. Båda adenovirus (AV) och adeno-associerat virus (AAV) har använts för cochlea gentillförsel. AAV är fördelaktiga i snäckan för ett antal skäl. De är replikeringsfattiga virus och kan effektivt överföra transgena molekyler till olika celltyper inklusive nervceller, ett viktigt mål för ett antal orsaker till hörselnedsättning. AAV inträde i cellen förmedlas av specifika receptorer ^2; Följaktligen får valet av en viss serotyp vara förenlig med de celltyper som ska transduceras. AAV kan effektivt transfektera hårceller ³ och införliva i värdgenomet, vilket resulterar i en stabil, långsiktig expression av den transgenic protein och fenotypisk förändring i cellen ^4. Även om inte nödvändigtvis fördelaktiga för kortsiktiga applikationer såsom hår-cellsregenere, är mycket viktigt för stabil räddning av genetiska defekter långsiktig expression. Eftersom AAV inte förknippas med någon mänsklig sjukdom eller infektion och demonstrera ingen ototoxicitet ^5,6,7, de är en idealisk kandidat för användning i genterapi för ärftliga former av hörselnedsättning ^8.

Överföring av genetiskt material i däggdjursinnerörat med hjälp virala vektorer har studerats under det senaste årtiondet och framstår som en lovande teknik för behandling både genetiska och förvärvade former av hörselnedsättning ^9. Snäckan är potentiellt ett idealiskt mål för genterapi av flera skäl: 1) dess liten volym nödvändiggör en begränsad mängd av viruset som behövs; 2) dess relativa isolering från andra organsystem gränser biverkningar; och 3) dess vätskefyllda kamrar underlättar virusleverans i hela labyrinten ^{10, 11,12,13,14, 15.}

Musmodeller av kongenital dövhet möjliggör en användning av många metoder för undersökning för att övervaka utvecklingen av innerörat på ett systematiskt, replikerbar sätt. Medan den lilla storleken hos mus hörselsnäckor medför några kirurgisk svårighet, tjänar musen som en extremt viktig modell i studien av genetisk hörselnedsättning, med flera experimentella fördelar jämfört med andra arter ^16. Musmodeller tillåter bedömning av en rad egenskaper genom genetisk kopplingsanalys, samling av detaljerade morfologiska observationer, och simulerar patogena scenarier; som sådana, de är goda kandidater för viralt medierad genterapi. Omfattande genetiska studier på möss i kombination med tekniska framsteg har gjort det möjligt att generera genetiskt modifierade möss på ett reproducerbart sätt över laboratorier ^{17,18, 19, 20,21.} Furthermore, finns det många modeller för både förvärvade och nedärvda hörselförlust fenotyper hos möss, vilket gör rigorösa tester i denna djurmodell ^{22, 23,24.} Således korrigera hörsel använder viralt medierad genterapi i en musmodell är ett lämpligt första steg i sökandet efter ett botemedel för mänskliga sjukdomar.

Vi har tidigare visat att transgena möss som saknar vesikulär glutamat transportör 3 (VGLUT3) föds döva på grund av brist på glutamatfrisättning vid IHC band synapsen ^25. Eftersom denna mutation inte leder till en primär degeneration av sensoriska hörselceller, dessa muterade möss är potentiellt en utmärkt modell, i vilken för att testa cochlea genterapi för medfödd hörselnedsättning.

Hittills har ett antal virala leveranstekniker för cochlea genterapi har beskrivits, inklusive runda fönstermembranet diffusion, runda fönstermembranet injektion, och tillförsel via en cochleostomy. Det finns potentaial fördelar och nackdelar med vart och ett av dessa tillvägagångssätt ^9.

Här rapporterar vi en kirurgisk metod för viralt medierad gentillförsel till VGLUT3 KO mouse innerörat genom det runda fönstermembranet (RWM). Den post aurikulär RWM injektion metod är minimalt invasiv med utmärkt hörsel konservering, och är relativt snabb. Som vi tidigare har publicerats, i ett försök att återställa hörseln i denna musmodell, var en AAV1 vektor bär VGLUT3 genen (AAV1-VGLUT3) införs i snäckan av dessa döva möss vid postnatal dag 12 (P! @), Vilket resulterar i restaurering av hörsel ^26. Utfrågning i VGLUT3 KO möss verifierades med hörselhjärnstammen svar (ABR), medan transgen proteinuttryck verifierades med hjälp immunofluorescens (IF). Denna metodik visar således att viralt medierad genterapi kan korrigera en genetisk defekt som annars skulle resulterar i dövhet.

Protocol

OBS: Alla förfaranden och djurhantering följs NIH etiska riktlinjer och godkända protokollkraven i Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of California, San Francisco. 1. Förbereda Animal för kirurgi Utför kirurgiska ingrepp i en ren, dedikerad utrymme. Autoklavera alla kirurgiska instrument, sterilisera med ett glas-pärla autoklav före operation. OBS: I detta protokoll använder postnatal dag 10-12 (P10-12) FVB möss. Olika åldrar och …

Representative Results

För att verifiera de tekniska egenskaperna och nyttan av efter auricular strategi för cochlea molekylär terapi, var AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP och AAV2-GFP levereras i P10-12 möss innerörat via RWM. Detta tillvägagångssätt visar framgångsrik transgenexpression inom inre hårcellerna (IHC) (VGLUT3 Figur 1 och GFP Figur 2 och GFP figur 3A), yttre hårcellerna (OHC) (GFP Figur 2) och stödjande celler (GFP Figur 2 och figur 3A)…

Discussion

I detta arbete har vi i detalj beskriva en teknik som kan användas för cochlea genterapi, med målet att återställa eller rädda normal hörselfunktion som äventyras av en genetisk defekt. Eftersom det är typiskt atraumatisk, är detta tillvägagångssätt säkert för överföring cochlea gen eller andra potentiella molekylära terapier ^30. Andra metoder för cochlea terapi har beskrivits, bland annat en ventral tillvägagångssätt ^24, cochleostomy ^31,32 och endolymphatic sac lev…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	Butler Schein
Xylazine	AnaSed
Acepromazine	Provided by UCSF LARC
Carprofen analgesia	Provided by UCSF LARC
Betadine	Betadine Puredue Pharma
dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex)	Alcon
Heating pad	Braintree scientific, inc.
25G needle	BD	305127
Borosilicate capillary pipette	World precision instruments, inc.	1B100F-4
Suture PDS*plus Antibacterial	Ethicon	PDP149
Tissue glue (Vetcode)	Butler Schein	31477
Rabbit Anti-GFP antibody	Invitrogen	A11122
Dissecting microscope	Leica		MZ95
Flaming/ Brown Micropipette	Sutter Instrument Co
Puller Model P-97
TDT BioSig III System	Tucker-Davis Technologies