Yuvarlak Pencere Membran aracılığıyla Fare İç Kulak için virally ve Gen Teslimat Cerrahi Yöntemi
Summary
The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane.
Abstract
Sensörinöral sağırlık fonksiyonel iyileşme elde etmek için kullanılan gen terapisi, işitme kaybı katkıda yatan moleküler ve genetik mekanizmaları daha iyi anlaşılmasını vermek için vaat ediyor. Iç kulak içine vektörlerin giriş mevcut yapılara yaralanmasına en aza yaygın koklea boyunca maddesi dağıtan bir şekilde yapılmalıdır. Bu yazının moleküler, farmakolojik ve fareler doğum sonrası gün 10 ve yuvarlak pencere membranı (RWM) üzerinden eski viral teslim kullanarak fare koklear tedavisi için kullanılabilecek bir post-aurikular cerrahi yaklaşım anlatılmaktadır. Kan kaybını en aza indirmek ve hayvan ölümleri kaçınarak bu cerrahi yaklaşım skala timpani'ye içine hızlı ve doğrudan teslim sağlar. Bu teknik, temel iç ve orta kulak yapıları yanı sıra boyun kasları tamamen işitme koruyarak ihmal edilebilir veya hiç hasar içerir. Bu cerrahi teknik, veziküler glutam etkinliğini göstermek için3 nakavt (KO VGLUT3) fareler bir adeno-bağlantılı virüs (AAV-1) iç kulağa VGLUT3 teslim aldıktan sonra işitme kurtarır konjenital sağırlık bir fare modelinde bir örnek olarak kullanılacaktır taşıyıcı yedi.
Introduction
Gen tedavisi uzun genetik işitme kaybı için potansiyel bir tedavi olarak öne sürülmüştür, ancak bu alanda başarı 1 zor kalmıştır. Bugüne kadar, viral aracılı metodolojiler nispeten ulaşılmaz koklea içinde belirli hücre türlerini hedef teorik yeteneği nedeniyle hakim olması. Her iki adenovirüs (AV), adeno-bağlantılı virüs (AAV), koklear gen aktarımı için kullanılmıştır. AAVler bir takım nedenlerden için kokleadaki avantajlıdır. Onlar çoğaltma eksikliği virüsler ve verimli nöronlar, işitme kaybının nedenleri bir dizi için önemli bir hedef gibi farklı hücre tiplerine transgenik molekülleri aktarabilirsiniz. Hücreye AAV giriş spesifik reseptörler 2 aracılık eder; hücre tipleri transduse edilmesi ile, böylece, belirli bir serotip tercih uyumlu olmalıdır. AAVler etkili saç hücreleri 3 transfekte Transformatörün istikrarlı, uzun vadeli ifade Elde edilen konakçı genomu içine dahil edilebilirnsgenic proteini ve hücre 4 fenotipik bir değişiklik. Bu tür saç hücre yenilenmesi gibi kısa süreli uygulamalar için gerekli olmayan, avantajlı olmasına rağmen, uzun vadeli ifade, genetik kusurların sabit kurtarma için çok önemlidir. AAVler herhangi bir insan hastalık ya da enfeksiyon ile bağlantılı hiçbir ototoksisiteye 5,6,7 göstermeyen, çünkü bunlar kaybı 8 işitme kalıtsal formları için gen terapisinde kullanım için ideal bir aday olup.
Viral vektörleri kullanılarak memeli iç kulak içine egzojen genetik madde aktarımı son on yıl içinde incelenmiştir ve zarar 9 işitme genetik ve elde edilen her iki formu da tedavisi için ümit vaadeden bir teknik olarak ortaya çıkmaktadır. koklea potansiyel çeşitli nedenlerle, gen terapisi için ideal bir hedeftir: küçük hacimli gerekli virüs sınırlı miktarda gerektiren 1); Diğer organ sistemleri limitleri yan etkilerinden 2) göreceli izolasyon; ve 3) kendi sıvı dolu odaları viral kolaylaştırmakLabirent 10, 11,12,13,14, 15 boyunca teslim.
Konjenital sağırlık Fare modelleri sistematik, yinelenebilir bir şekilde iç kulak gelişimini izlemek için çalışmanın birçok yöntem kullanımına izin verir. Fare cochleae küçük boyutu, bazı cerrahi zorluk sunmak yok iken, fare diğer türlerin üzerinde 16 çeşitli deneysel avantajları ile genetik işitme kaybı çalışmada son derece önemli bir model olarak hizmet vermektedir. Fare modelleri genetik bağlantı analizi, detaylı morfolojik gözlemler toplanması ve patojenik senaryoları simüle edilerek özellikleri bir dizi değerlendirilmesine olanak; gibi, bu viral olarak aracılık edilen, gen terapisi için iyi adaylardır. Teknolojik gelişmeler ile birlikte farelerde Kapsamlı genetik çalışmalar mümkün laboratuvarlarda 17,18, 19, 20,21 arasında bir tekrarlanabilir şekilde genetiği değiştirilmiş fareler üretmek için yaptık. Furthermorhem edinilmiş ve bu hayvan modelinde 22, 23,24 titiz test sağlayan, farelerde işitme kaybı fenotipleri kalıtsal e, sayısız modelleri de bulunmaktadır. Bu durumda, bir fare modelinde, viral aracılı gen terapisi kullanılarak işitme düzeltmek insan hastalığı için bir tedavi arayışında uygun bir ilk adımdır.
Biz daha önce veziküler glutamat taşıyıcı 3 (VGLUT3) eksik transgenik fareler nedeniyle İHK şerit sinaps 25 glutamat salınımı eksikliği sağır doğarlar olduğunu göstermiştir. Bu mutasyon duyusal saç hücrelerinin birincil dejenerasyonuna yol olmadığından, bu mutant fareler potansiyel doğumsal işitme kaybı için koklear gen tedavisi sınamak için mükemmel bir modeldir.
Bugüne kadar, koklear gen terapisi için viral uygulama teknikleri sayıda kokleostomisi ile yuvarlak cam membran yayılma, yuvarlak cam membran enjeksiyonu ve verme dahil olmak üzere tarif edilmiştir. Güçlü vardırial avantajları ve bu yaklaşımların 9 her dezavantajları.
Burada yuvarlak pencere membranı (RWM) üzerinden VGLUT3 KO fare iç kulağa viral aracılı gen aktarımı için cerrahi bir yöntem sunulmaktadır. sonrası auricular RWM enjeksiyon yöntemi mükemmel işitme koruma ile minimal invaziv ve nispeten hızlı. Daha önce yayınlanmış gibi, bu fare modelinde işitme geri bir çaba, VGLUT3 genini (AAV1-VGLUT3) taşıyan bir AAV1 vektör doğum sonrası 12. günde de bu sağır farelerin koklea içine tanıtıldı (P! @), Sonuçlanan 26 işitme restorasyonu. Transgen protein ifadesi immünoflüoresans (IF) ile doğrulandı iken VGLUT3 KO farelerde İşitme, işitsel beyin sapı cevabı (ABR) tarafından doğrulandı. Bu metodoloji, böylece viral-aracılı gen terapisi olur, aksi takdirde sağırlık neden genetik kusur düzeltmek olduğunu göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, ayrıntılı olarak yeniden veya bir genetik kusur tarafından tehlikeye normal işitsel fonksiyon kurtarmak amacı ile, koklear gen terapisi için kullanılan bir tekniği açıklar. Genellikle atravmatik olduğu için, bu yaklaşım koklear gen transferi ya da diğer olası moleküler tedaviler 30 için güvenlidir. Koklear tedavisi için başka bir yaklaşım, ventral yaklaşımla 24, fare ve gine domuzunda kokleostomisi 31,32 ve endolenfatik kese teslimat 33</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by an R21 grant from the National Institutes of Health and by a grant from Hearing Research, Incorporated.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Butler Schein | ||
| Xylazine | AnaSed | ||
| Acepromazine | Provided by UCSF LARC | ||
| Carprofen analgesia | Provided by UCSF LARC | ||
| Betadine | Betadine Puredue Pharma | ||
| dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) | Alcon | ||
| Heating pad | Braintree scientific, inc. | ||
| 25G needle | BD | 305127 | |
| Borosilicate capillary pipette | World precision instruments, inc. | 1B100F-4 | |
| Suture PDS*plus Antibacterial | Ethicon | PDP149 | |
| Tissue glue (Vetcode) | Butler Schein | 31477 | |
| Rabbit Anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Dissecting microscope | Leica | MZ95 | |
| Flaming/ Brown Micropipette | Sutter Instrument Co | ||
| Puller Model P-97 | |||
| TDT BioSig III System | Tucker-Davis Technologies |
References
- Jero, J., et al. Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse. Hum. Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).
- Nam, H. J., et al. Structure of adeno-associated virus serotype 8, a gene therapy vector. J. Virol. 81 (22), 12260-12271 (2007).
- Ryan, A. F., Mullen, L. M., Doherty, J. K. Cellular targeting for cochlear gene therapy. Adv Otorhinolaryngol. 66, 99-115 (2009).
- Xia, L., Yin, S., Wang, J. Inner ear gene trasfection in neonatal mice using adeno-associate viral vwctor: a comparison of two approaches. PLoS One. 7 (8), e43218 (2012).
- Husseman, J., Raphael, Y. Gene therapy in the inner ear using adenovirus vectors. AdvOtorhinolaryngol. 66, 37-51 (2009).
- Ballana, E., et al. Efficient and specific transduction of cochlear supporting cells by adeno-associated virus serotype 5. Neurosci. Lett. 442 (2), 134-139 (2008).
- Praetorius, M., et al. Adenoviral vectors for improved gene delivery to the inner ear. Hear. Re. 248 (1-2), 31-38 (2009).
- Kay, M. A., Glorioso, C. G., Naldini, L. Viral vectors for gene therapy: the art of turning infectious agents into vehicles of therapeutics. Nature Medicine. 7 (1), 33-40 (2001).
- Kesser, B. W., Lalwani, A. K., Ryan, A. F. Gene Therapy and Stem Cell Transplantation: Strategies for Hearing Restoration. Adv Otorhinolaryngol. 66, 64-86 (2009).
- Cooper, L. B., et al. AAV-mediated delivery of the caspase inhibitor XIAP protects against cisplatin ototoxicity. Otol. Neurotol. 27 (4), 484-490 (2006).
- Gratton, M. A., Salvi, R. J., Kamen, B. A., Saunders, S. S. Interaction of cisplatin and noise on the peripheral auditory system. Hear. Res. 50 (1-2), 211-223 (1990).
- Lalwani, A. K., Walsh, B. J., Reilly, P. G., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig. Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).
- Kesser, B. W., Hashisaki, G. T., Holt, J. R. Gene Transfer in Human Vestibular Epithelia and the Prospects for Inner Ear Gene Therapy. Laryngoscope. 118 (5), 821-831 (2008).
- Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat. Med. 11 (3), 271-276 (2005).
- Praetorius, M., et al. Adenovector-mediated hair cell regeneration is affected. Acta Otolaryngol. 130 (2), 215-222 (2009).
- Friedman, L. M., Dror, A. A., Avraham, K. B. Mouse models to study inner ear development and hereditary hearing loss. Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 609-631 (2007).
- Chang, E. H., Van Camp, G., Smith, R. J. The role of connexins in human disease. Ear Hear. 24 (4), 314-323 (2003).
- Cohen-Salmon, M., et al. Targeted ablation of connexin26 in the inner ear epithelial gap junction network causes hearing impairment and cell death. Curr. Biol. 12 (13), 1106-1111 (2002).
- Nickel, R., Forge, A. Gap junctions and connexins in the inner ear: their roles in homeostasis and deafness. Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 16 (5), 452-457 (2008).
- Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss. J. Biol. Chem. 285 (45), 34699-34707 (2010).
- Leibovici, M., Safieddine, S., Petit, C. Mouse models for human hereditary deafness. Curr. Top. Dev. Biol. 84, 385-429 (2008).
- Dror, A. A., Avraham, K. B. Hearing loss: mechanisms revealed by genetics and cell biology. Annu. Rev. Genet. 43, 411-437 (2009).
- Richardson, G. P., de Monvel, J. B., Petit, C. How the genetics of deafness illuminates auditory physiology. Annu. Rev. Physiol. 73, 311-334 (2011).
- Jero, J., Tseng, C. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. A surgical approach appropriate for targeted cochlear gene therapy in the mouse. Hearing Research. 151 (1-2), 106-114 (2001).
- Seal, R. P., et al. Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3. Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).
- Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
- Akil, O., et al. Progressive deafness and altered cochlear innervation in knock-out mice lacking prosaposin. J. Neurosci. 26 (5), 13076-13088 (2006).
- Fremeau, R. T., et al. Vesicular glutamate transporters 1 and 2 target to functionally distinct synaptic release sites. Science. 304 (5678), 1815-1819 (2004).
- Akil, O., Lustig, L. R. Mouse Cochlear Whole Mount Immunofluorescence. Bio-protocol. , (2013).
- Kho, S. T., Pettis, R. M., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. Cochlea microinjection and its effects upon auditory function in guinea pig. Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).
- Iizuka, T., et al. Noninvasive in vivo delivery of transgene via adeno-associated virus into supporting cells of the neonatal mouse cochlea. Hum. Gene Ther. 19 (4), 384-390 (2008).
- Kilpatrick, L. A., et al. Adeno-associated virus-mediated gene delivery into the scala media of the normal and deafened adult mouse ear. Gene Ther. 18 (6), 569-578 (2011).
- Yamasoba, T., Yagi, M., Roessler, B. J., Miller, J. M., Raphael, Y. Inner Ear Transgene Expressionafter Adenoviral Vector Inoculation in the Endolymphatic Sac Hum. Gene Ther. 10 (5), 769-774 (1999).
- Praetorius, M., Baker, K., Weich, C. M., Plinkert, P. K., Staecker, H. Hearing preservation after inner ear gene therapy: the effect of vector and surgical approach. ORL J. Otorhinolaryngol. Relat. Spec. 65 (4), 211-214 (2003).
- Carvalho, G. J., Lalwani, A. K. The effect of cochleaostomy and intracochlear infusion on auditory brain stem response threshold in the guinea pig. Am. J. Otol. 20 (1), 87-90 (1999).
- Kawamoto, K., Oh, S. H., Kanzaki, S., Brown, N., Raphael, Y. The Functional and Structural Outcome of Inner Ear Gene Transfer via the Vestibular and Cochlear Fluids in Mice. Mol. Ther. 4 (6), 575-585 (2001).
- Lalwani, A. K., Han, J. J., Walsh, B. J., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. Green fluorescent protein as a reporter for gene transfer studies in the cochlea. Hear Res. 114 (1-2), 139-147 (1997).
- Lalwani, A. K., et al. Long-term in vivo cochlear transgene expression mediated by recombinant adeno-associated virus. Gene Ther. 5 (2), 277-281 (1998).
- Raphael, Y., Frisancho, J. C., Roessler, B. J. Adenoviral-mediated gene transfer into guinea pig cochlear cells in vivo. Neurosci. Lett. 207 (2), 137-141 (1996).
- Weiss, M. A., Frisancho, J. C., Roessler, B. J., Raphael, Y. Viral mediated gene transfer in the cochlea. Int. J. Dev. Neurosci. 15 (4=5), 577-583 (1997).
- Pettis, R. M., Han, J. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. Intracochlear infusion of recombinant adeno associated virus: Analysis of its dissemination to near and distant tissues. Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. 21, 673 (1998).
- Konish, i. M., Kawamoto, K., Izumikawa, M., Kuriyama, H., Yamashita, T. Gene transfer into guinea pig cochlea using adeno-associated virus vectors. J. Gene Med. 10 (6), 610-618 (2008).
- Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nature Genetics. 8 (2), 148-154 (1994).
