A highly reproducible model for myocardial infarction in mice with minimal invasive manipulations is described. The model can be easily performed, resulting in a high reproducibility and survival rate. Thus, the described model will reduce the number of required animals as requested by the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction).
O infarto do miocárdio ainda permanece a principal causa de morte nos países ocidentais, apesar de progressos consideráveis na área de desenvolvimento de stent nas últimas décadas. Para esclarecimento dos mecanismos subjacentes eo desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas, a disponibilidade de modelos animais válidos são obrigatórios. Desde que nós precisamos de novos insights sobre pathomechanisms de doenças cardiovasculares sob as condições in vivo para combater infarto do miocárdio, a validade do modelo animal é um aspecto crucial. No entanto, a protecção dos animais são altamente relevantes neste contexto. Portanto, estabelecer um modelo minimamente invasiva e simples de infarto do miocárdio em ratos, o que garante uma alta reprodutibilidade ea taxa de sobrevivência dos animais. Assim, este modelos satisfaz as exigências do princípio 3R (substituição, aperfeiçoamento e redução) para experimentos com animais e assegurar a informação científica necessária para posterior desenvolvimento de estratégias terapêuticas para cardiovdoenças ascular.
O infarto do miocárdio é uma das principais causas de morte nos países industrializados. Apesar do progresso inegável de abordagens diagnósticas e terapêuticas, as doenças cardiovasculares ainda são a principal causa de mortalidade. Dada a expectativa de vida melhorou e os riscos relacionados com a vida, é esperado um aumento contínuo na incidência de doenças cardiovasculares no futuro. Por conseguinte, existe uma forte necessidade de estabelecer e validar novas abordagens para o tratamento de doenças cardiovasculares. As informações de estudos em seres humanos sofrem de suas limitações, esses estudos geralmente são insuficientes para explicar e compreender os mecanismos a nível molecular, sendo incapaz de fornecer soluções para estes graves problemas de saúde.
Além disso, a pesquisa básica tem sido limitada devido à complexidade e dificuldade para reproduzir os mecanismos de doenças cardiovasculares em laboratório. Portanto, para aumentar o nosso conhecimento sobre a fisiopatologia de cardiodoenças vasculares, é essencial para validar modelos animais 1,2. No entanto, para identificar todas as cascatas de eventos moleculares envolvidos na cicatrização após enfarte do miocárdio, a análise em diferentes pontos de tempo é necessário, causando um grande número de experiências animais.
Experimentos de infarto do miocárdio são muitas vezes realizadas usando modelos animais. Induzindo o infarto do miocárdio em pequenos animais 11/03 é o modelo mais adequado e eficiente empregada para investigar eventos celulares e moleculares do que as grandes modelos animais. Além disso, nenhuma outra espécie apresenta a disponibilidade das estirpes transgénicas ou como ratinhos knockout 12. Estes modelos de ratinho são altamente úteis em outras doenças, incluindo patologias cardiovasculares (tal como a aterosclerose, a restenose de stents) 13,14. Além disso, o período de gravidez de baixo e do elevado número de progênies qualificar modelos de mouse como o sistema mais atraente para estudar mecanismos moleculares de infa miocárdiorction 12.
No entanto, o tamanho do coração nos ratos espera alta precisão da manipulação durante a microcirurgia. Ensinar esse pessoal de cirurgia qualificados e especializados é um demorado e processo intensivo de trabalho. Portanto, aqui apresentamos um procedimento de microcirurgia detalhada, incluindo dicas e truques para orientar os colaboradores, mesmo com qualificações médias, como estudantes ou técnicos para executar o modelo de infarto do miocárdio complexo em camundongos.
Inicialmente, a intubação é realizada por meio de uma pequena cânula, sem utilizar a traqueotomia. A incisão torácica está localizado na área intercostal, evitando lesões de nervuras ou / e do tecido circundante. Esta sub-passo é altamente relevante para assegurar a recuperação e cura de 15 rápido. A ligadura é feita diferencial para modelos de isquemia crônica e isquemia / reperfusão, para uma elevada taxa de sobrevivência, mantendo um tamanho significativo infarto. Nossa experiência mostra that usando sutura de seda garante uma reprodutibilidade maior em comparação com crio lesões 16.
Em conclusão, o método aqui descrito é aplicável em ambos os modelos de isquémia crónica e isquemia / reperfusão, em animais de pequeno porte. As dicas e truques apresentados neste procedimento são destinadas a permitir que o pessoal com qualificação ainda baixa ou média para aplicá-lo em pequenos modelos animais.
Durante o procedimento, há alguns pontos críticos a serem observados: a intubação, a abertura da cavidade torácica ea ligadura LAD. O primeiro passo crítico é a intubação do animal antes experiements. Muitos grupos são usando um suporte vertical para a fixação do rato e uma fonte de luz para inserir a cânula directamente na traqueia. Este método tem incerteza quanto à inserção correta da cânula na traquéia e é a mais propensos a falhas pelos novatos. Fazendo uma pequena incisão, a posição da cânula pode ser controlada durante toda a manobra, diminuindo assim a taxa padrão. Além disso, a traqueotomia é ultrapassado, diminuindo assim as complicações e reduzir o tempo de operação.
O próximo passo é crítico da abertura da cavidade torácica. A esternotomia mediana representa uma manobra de alto risco atrasar a recuperação dos animais. A incisão lateral esquerdo que implica o corte de 2-3 costelas 15 </sup>, leva a recuperação deficiente e aumento da mortalidade. Nós utilizado no modelo de pequena incisão, discreta entre as costelas que oferecem carga mínima. Os animais recuperar muito rapidamente após a cirurgia e não apresentam defeitos ou cura perturbado. O espaço inter-costal inferior é tomado como ponto de referência. Considerando isso, o acesso adequado e diferenciado para o lugar ligadura para crônico e isquemia / reperfusão modelo, não levanta problemas sérios.
A ligadura si representa o passo mais crítico. A artéria coronária descendente esquerda é difícil de ser visualizada, e muitas vezes precisa ser vinculado sem vista. Por isso, alguns pontos de referência anatômicos são apontados para ajudar o cirurgião a realizar a ligação correta. Para o modelo de enfarte crónico, a ligadura é colocada no meio do lado ventral do coração, entre a aurícula e o vértice, acima do fim da veia principal anterior (Figura 2B). A eficiência pode ser controencheram visualizando a aparência da cor cinzenta nas áreas afectadas. Se a área enfartada aparece anterior e não inclui a parede posterior, um novo fio de sutura pode ser colocado à esquerda do primeiro fio de sutura. A principal raiz do LAD é sempre visível sob a orelha 18 e, portanto, não apresenta graves problemas em detectar esta parte. No entanto, a aurícula apresenta o maior risco de sangramento e precisa ser tratado com cuidado.
O procedimento é limitada pela existência de equipamento adequado. Um sistema de anestesia adequada ventilador e para os pequenos animais são caros e requerem conexões com sistema de gás e ventilação da sala. Além disso, uma supervisão rigorosa dos animais é necessária na primeira semana após o procedimento para detectar a possível clínica. Para examinar a função cardíaca durante o experimento, de alta resolução ultra-som, complexo do sistema de perfusão Langendorf, ou pequenas medições cateter intraventricular são necessários, involving altos custos e conhecimentos adicionais.
Considerando-se o enfarte do miocárdio, não há métodos alternativos disponíveis para reproduzir a complexidade dos acontecimentos in vitro. Dependendo do ponto de interesse, ex vivo de perfusão de coração isolado no sistema de Langendorff fornece informações sobre a contratilidade, a função cardíaca e viabilidade miocárdica em resposta a diferentes estímulos ou drogas. No entanto, exclui todas as interferências de componentes do sangue e do sistema imunitário, e não é indicado para estudos de longo-de remodelação e cicatrização após infarto do miocárdio.
Depois de realizado o procedimento de enfarte do miocárdio, todos os outros análise funcional pode ser realizada, como medições da pressão intraventricular, ultra-som (sistemas de ultra-som pequeno animal) ou isolado do coração de Langendorff-perfusão. Além disso, todas as análises biológicas e moleculares podem ser realizados para identificar células, proteínas, mRNAs, microARNs, GEnes ou outros biomarcadores, que podem ser utilizados como alvos terapêuticos para o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento de enfarte do miocárdio.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by Interdisciplinary Centre for Clinical Research IZKF Aachen (junior research group to E.A.L.) within the faculty of Medicine at RWTH Aachen University. We are grateful Dr. Rusu and Ashley Christina Vourakis for critical review of the manuscript and Mrs. Roya Soltan for the professional help with immunohistochemistry staining.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Stereomicroscope | Olympus | SZ/X9 | |
Mouse ventilator | Harvard Apparatus | 730043 | Model Minient 845 |
Dual Anesthesia System (Tabletop Version) | Harvard Apparatus | Selfcontained isofluranebased anesthesia unit for use on lab tables, with a compact 8" x 11" footprint. | |
Intubation cannula | Harvard Apparatus | 732737 | |
Forceps | FST, Germany | 9119700 | standard tip curved 0.17 mm x 0.1 mm |
Scissors | FST, Germany | 9146011 | straight |
Vannas scissor | Aesculap, Germany | OC 498 R | |
Retractors | FST, Germany | 1820010 | 2.5mm wide |
Retractors | FST, Germany | 1820011 | 5mm wide |
Wire handles | FST, Germany | 1820005 | 10cm |
Wire handles | FST, Germany | 1820006 | 14cm |
Ketamine 10% | CEVA, Germany | ||
Xylazine 2% | Medistar, Germany | ||
Bepanthene eye and nose cream | Bayer, Germany | ||
Silicon tube | IFK Isofluor, Germany | custommade product | diameter 500µm |
section thickness 100 µm | |||
polytetrafluorethylene catheter | |||
PROLENE Suture 6/0 | ETHICON | 8707H | polypropylene monofilament suture, unresorbable, needle CC1, 13mm, 3/8 Circle |
7/0 Silk | Seraflex | IC 1005171Z | |
Ultrasound | Vevo, Canada | 770 Vevo |