Spesifisitet Analyse av Protein Lysin metyltransferaser hjelp SPOT Peptide Arrays

Summary

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

Abstract

Lysin metylering er en ny post-oversettelse modifikasjon og det har blitt identifisert på flere histone og ikke-histonproteiner, hvor den spiller avgjørende roller i celle utvikling og mange sykdommer. Omtrent 5000 lysin metylering områder ble identifisert på ulike proteiner, som er satt av noen titalls protein lysin metyltransferaser. Dette tyder på at hver PKMT methylates flere proteiner, men til nå bare én eller to underlag er identifisert for flere av disse enzymene. Å nærme seg dette problemet, har vi innført peptid matrise basert substratspesifisiteten analyser av PKMTs. Peptid arrays er kraftige verktøy for å karakter spesifisiteten av PKMTs fordi metylering av flere underlag med forskjellige sekvenser kan testes på en array. Vi syntetiserte peptid arrays på cellulose membran ved hjelp av en Intavis SPOT synthesizer og analysert spesifisiteten av ulike PKMTs. Basert på resultatene, for flere av disse enzymene, roman substrates kunne identifiseres. For eksempel, for NSD1 ved anvendelse av peptid-matriser, viste vi at det methylates K44 for H4 stedet for den rapporterte H4K20 og i tillegg H1.5K168 er den svært foretrukket substrat over tidligere kjent H3K36. Derfor peptid arrays er kraftige verktøy til biokjemisk karakteriserer PKMTs.

Introduction

I de siste to tiårene, flere rapporter vist betydningen av post-translasjonelle modifikasjoner (PTM) i mobilnettet utvikling og flere sykdommer som kreft, men nylig protein lysin metylering har dukket opp som en annen viktig PTM. Selv om utgangspunktet Histone lysin metylering ble funnet å være en viktig kromatin mark, viste senere arbeid også lysin metylering av flere ikke-histonproteiner ^1-4. Den sekvensielle overføring av metylgrupper fra S-adenosyl-L-metionin til ε-aminogruppen i lysinrester katalyseres av en familie av enzymer som kalles protein lysin metyltransferaser (PKMTs) som inneholder mer enn 60 proteiner i det humane genomet. PKMTs ble først oppdaget som histon modifisere enzymer som metilat spesifikk lysinrest men senere rapporter viste at de kunne også metilat ikke-histonproteiner ^5. Opp til nå, ble omtrent 5000 lysin metylering områder identifisert på ulike proteiner ⁶ </sopp>, men enzymer som er ansvarlig for disse endringene er ofte ikke identifisert. En grunn til dette er at det spesielle ved de fleste PKMTs ikke har blitt studert inngå. Derfor, det recurrently skjer at nye substrater av PKMTs blir oppdaget. Mangelen på en detaljert kunnskap om underlaget spesifisitet PKMTs hindrer forståelse av deres biologiske funksjon og rolle. For å undersøke spesifisiteten av en PKMT i detalj, må metylering forekomst av mange peptidsubstrater som skiller seg i en eller noen få aminosyrer bli målt og sammenlignet, noe som er ideelt gjøres ved hjelp av peptid-arrayer. Basert på de oppnådde spesifisitet profiler, kan potensielle substrater av PKMTs identifiseres som kan studeres nærmere.

Peptid arrays er mye brukt verktøy for biokjemisk analyse av antistoffer, peptid modifiserende enzymer og kartlegging av protein-protein interaksjon sider (antistoff-antigen-reseptor-ligand) ^7-9. Flere hundre peptider er nødvendig for such applikasjoner. Forskjellige metoder er tilgjengelige for peptidsyntese, blant dem peptidsyntese på harpiksen blir svært ofte brukt, men har begrensninger i gjennomstrømningen, og det er relativt dyrt. Disse problemene ble løst med innføring av SPOT syntesemetode av Frank og kolleger ^10. SPOT syntesemetode tillater syntese av flere hundre peptider i parallell, og i gjennomsnitt er det billig sammenlignet med harpikssyntesen. Peptidene syntetisert på cellulosemembran kan anvendes enten direkte for ulike applikasjoner eller peptider kan bli spaltet fra membranen og anvendt som frie peptider i løsning for analyser eller for å fremstille peptid-mikromatriser ^10-13.

SPOT-syntesen er en variant av den faste fase peptid-syntese, som anvender en cellulosemembran som en fast bærer, og anvender standard Fmoc-kjemi ^10-13. Derfor syntesen av peptidkjeder begynner ved den C-terminale enden og fortsetter langsden N-terminale ende i motsetning til den biologiske syntese i ribosomer. Cellulosemembraner er funksjonalisert til å feste det første aktiverte aminosyrer (fig. 1). SPOT metoden er basert på den sekvensielle levering av aktiverte aminosyrer i en dråpe av oppløsningsmiddel til definerte steder på membranen ved hjelp av et automatisert system pipettering. Dråpen av flytende dispenseres på den porøse membranen, der den danner en sirkulær våt flekk, som senere opptrer som en åpen reaktor for kjemiske reaksjoner i peptidsyntese. Den punktstørrelse bestemmes av volumet dispenseres og absorpsjonskapasitet av membranen, er multipler av slike flekker anordnet som matriser. Omfanget av syntese korrelerer med punktstørrelse og lastekapasitet av membranen. Avstanden mellom flekker og tettheten av arrays styres ved å variere spot størrelser. Cellulosemembranen har flere fordeler som fast fase i peptidsyntese, det er billig, tolerant til chemicals brukes i peptidsyntese, stabile i vandige oppløsninger og lett å håndtere. I tillegg gjør dens hydrofile natur det passer til flere biologiske analysesystemer. SPOT syntesen kan utføres manuelt eller automatisk (for 1000 av peptider), avhengig av det nødvendige antall peptider. En helautomatisk SPOT synthesizer fra Intavis (Köln, Tyskland) brukes for våre applikasjoner. Det tillater syntese av peptider i forskjellige mengder og med forskjellig lengde. Lineære peptider er regelmessig syntetisert med 15 til 20 aminosyrer lang, i tillegg til peptidene på opp til 42 aminosyre kan også fremstilles ved trinnvis syntese ^14,15. Imidlertid øker antallet av aminosyrer fører til reduksjon i den samlede koblings utbytter, noe som påvirker kvaliteten av peptidene. På grunn av den lave mengden av peptider pr flekk, produktene er ofte vanskelig å rense, og kvaliteten på de enkelte peptider ikke lett kan vurderes. Derfor er resultatene hentet fra SPOT PeptIDE matrisene må bli bekreftet enten med peptider syntetisert ved hjelp av standardmetoder i større målestokk, som kan bli renset og analysert i henhold til standarder i peptidsyntese eller ved syntetisering av proteiner inneholdende de ønskede peptidsekvenser. Likevel fant vi SPOT syntese å være svært pålitelig og gir vanligvis å være reproduserbar. SPOT syntese er ikke begrenset til proteinogene aminosyrer, flere kommersielt tilgjengelige modifiserte aminosyrer også kan anvendes for syntese, slik at peptidene for å bli modifisert før og etter den endelige spaltning av sidekjedebeskyttelsesgruppen og, videre, er det også mulig inkorporering av fosforylerte, denaturert eller acetylerte aminosyrer ^11.

Immobiliserte peptid-bibliotek syntetisert ved SPOT metoden kan brukes direkte for mange biologiske og biokjemiske analyser. Vi ansatt peptid arrays omfatter 300-400 peptider å undersøke substratspesifisiteten av PKMTs. For enzymatisk modifikation er peptid arrays inkubert med de respektive PKMT og merket [metyl- ^3H] -AdoMet i en egnet buffer. Metylering av det respektive substrat blir analysert ved å følge den enzymatiske overføring av de radioaktivt merkede metylgrupper fra AdoMet til det peptidsubstrat via autoradiografi (fig. 3). Ved denne fremgangsmåten kan de peptid-arrays tillater studiet av metylering av ulike peptidsubstrater samtidig. En viktig fordel med denne metoden er at alle peptider er metylert i konkurransen, slik at under den lineære fase av metylering kinetikk, er den relative metylering av hvert peptid proporsjonal med den katalytiske hastighetskonstant dividert med dissosiasjonskonstant (k _cat / K _D) av enzymet til det respektive peptid-substrat. Derfor er mengden radioaktivitet inkorporert i hver flekk direkte korrelert med den enzymatiske aktiviteten til det bestemte peptidet. BrukeResultatene av et peptid matrise metylering eksperiment, kan spesifisiteten profil av PKMT være definert, og basert på denne nye substrater kan være betinget av. Peptid arrays tillate rask og kostnadseffektiv validering av metylering av nye substrater ved peptid-nivå. For dette er arrays forberedt som inneholder den anslåtte nye underlag sammen med modifiserte peptider som inneholder en Ala istedenfor Lys på målse samt positive og negative kontroll peptider. Endelig kan de nye substrater fremstilles som proteiner sammen med mutanter, hvor målet Lys er endret til Ala og metyleringen kan bli bekreftet på proteinnivå. Avhengig av resultatene, er dette da etterfulgt av biologiske undersøkelser rettet mot potensielle roller metylering av de nylig beskrevet proteinsubstrater.

Protocol

1. Utarbeidelse av Peptide Arrays Programmering av peptidsekvensene Designe peptidsekvenser for syntesen bruker MultiPep Spotter programvare. Tast peptidsekvensene i enkeltbokstavkoder. Peptid 1: TARKSTGGKA Generere alanine eller arginin gange biblioteker med en bestemt kommando (.Sett, A) for å skjerme de viktige aminosyrer som kreves for godkjenning av et definert underlag. For eksempel i det følgende eksempel den første linjen er villtypesekvensen og fra den andre linjen hver a…

Representative Results

Peptid arrays ble med hell brukt til biokjemisk karakter spesifisiteten av PKMTs, og flere roman histone og ikke-histone substrater av PKMT ble identifisert ved denne tilnærmingen 5,16-19. Definere riktig underlaget spekteret av en PKMT (eller en hvilken som helst enzym) er et viktig skritt videre i forståelsen av sin molekylære mekanismen og cellulære funksjoner. Som et eksempel på anvendelsen av peptidet SPOT matrise metylering fremgangsmåte, beskriver vi resultatene av sp…

Discussion

SPOT syntese som beskrevet her er en kraftig metode for å kartlegge protein-protein interaksjonssider og undersøke underlaget anerkjennelse av peptid modifisere enzymer. Imidlertid har SPOT syntesen fremdeles visse ulemper, fordi selv om peptidene syntetisert ved SPOT metoden er rapportert å ha mer enn 90% renhet ²¹ dette er vanskelig å få bekreftet i hvert tilfelle. Derfor må resultatene gjengis ved andre fremgangsmåter for eksempel ved hjelp av proteindomener eller med rensede peptider syntetisert ve…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Ethanol abs Gradient Grade HPLC	Honeywell	10299901	Flammable
N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis	Biosolve	4193302	Flammable, Toxic
Piperidine ≥ 99 % for Peptide Synthesis	Roth	A122.1	Flammable, Toxic, corrosive
Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate )	Novabiochem	8510860100
N,N’-Diisopropylcarbodiimide purum ≥ 98% GC	Fluka	38370	Flammable, Toxic, corrosive
Acetic anhydride	Roth	CP28.1	Flammable, Toxic, corrosive
Triisopropylsilane 99%,	Aldrich	233781	Flammable, Toxic
Dichlormethane ≥99,9%	Roth	P089.1	Carcinogenic
N-Methyl-2-Pyrrolidone	Roth	4306.2	Toxic
Derivatized cellulose Membrane	Intavis AG Köln	32.1
Trifluoroacetic acid	Roth	P088.2	Toxic, corrosive
Bromphenolblue	AppliChem	A3640.0010
Ammonium Hydrogen Carbonate	Roth	T871.2	Toxic
Sodium Dodecyl Sulfate Pellets	Roth	CN30.3	Toxic, Flammable
MultiPep Synthesizer	Intavis AG Köln	n.a.
HyperfilmTM high performance film	GE Healthcare	28906837
Phoretix software	TotalLab	n.a.