Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.
The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood.
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.
고도로 전문화 된 혈액 – 뇌 장벽 (BBB)의 일부입니다 뇌 미세 혈관 내피 세포 (BMEC) 형태의 단일 층. BMECs은 기저막에 부착 접합부 단백질에 의해 서로 연결되어있다. 함께 혈관 주위 세포, 평활근 세포, 성상 교세포 단부 피트와 순환 혈구 그들은 소위 신경 혈관 부 (NVU)를 하나 구축. 혈액과 중앙 신경계 (CNS) 간의 불 투과성 장벽의 이전의 개념에 대하여, NVU은 뇌 혈관 및 CNS (2) 사이의 유체 분자와 세포의 전이를 제어하는 동적 고도로 특이적이고 규제 인터페이스 . NVU의 장애 또는 이상 조절이 개시 및 / 또는 허혈성 뇌졸중, HIV-뇌증, 다발성 경화증, 알츠하이머 병 또는 파킨슨 병과 같은 3-6 CNS의 신경 혈관, 감염성 염증성 또는 퇴행성 질환의 종류에 기여할 수있다.
_content "> BMEC 단층 단단히 꽉 (TJ)로 구성 접합부 복잡한에 의해 밀봉되어 (AJ) 7. 높은 전기 저항과 BBB의 낮은 세포층의 투과성은 주로 TJ 단백질을 기반으로 접합 8. TJS은 adherens 이러한 zonulaoccludens (ZO) 단백질과 같은 어댑터 분자에 의해 내피 세포의 세포 골격에 연결되어 클라우딘 및 occludin 가족 경막 단백질에 의해 형성된 복합체 ZO1-3 4 Adherens 접합은 주로 막 관통 단백질에 의해 조립된다. catenins (8)를 통해 세포 골격에 연결되어 혈관 내피 세포 (VE) -cadherin.BBB의 기밀 유지는 혈액과 뇌척수액 사이의 기판과 세포의 무료 교환을 방지 할 수 있습니다. 이 규칙에 예외가 지질 매개 확산 9 BBB를 통과 할 수있는 분자량 <400 다와 친 유성, 작은 분자이다. 통로의 더 큰 및 / 또는글루코스, 아미노산, 펩티드, 단백질 및 많은 약물 친수성 분자는 다섯 가지 주요 범주로 분류 될 수 고도로 제어 된 세포 횡단 운송 시스템 (10)으로 제한된다 : 캐리어 매개 수송, 이온 수송 활성 유출 수송 수용체 매개 전송 및 카베 올래 매개 교통편 4. 이러한 수송 시스템은 정확한 신호 생성, 전달 및 통합에 필요한 CNS의 항상성을 유지하는 데 도움. 더욱이 BMECs 적극적 ectoenzymes의 다양한 표현에 의해 구별 분자의 전환을 제어 할 수있다. 이러한 효소 저해 또는 BBB (11)의 전환을 가능하게 특정 내인성 및 외인성 기질 세포 표면 상에 집중하고 수정할 수있다.
CNS는 오랜 시간 동안 면역 권한 기관으로 간주 된 반면, 최근의 연구 결과는 면역 surv의 다소 역동적이고 엄격하게 규제 시스템을 제안CNS의 eillance. BMECs 비판적으로 면역 세포 윤회의 조절에 관여한다. 그들의 표면 림프구에 셀렉틴의 발현에 의해 선택적으로 느슨하게 내피 세포에 부착하도록 유도한다. 백혈구의 특정 수용체 발생할 케모카인의 분비 발현 또는 LFA-1과 백혈구 인테그린의 구조 변화, 리드 (림프구 기능 관련 항원 1) 및 VLA-4 (매우 늦은 항원 -4). 인테그린 사이 또는 BBB 12-14 BMECs 통해 뇌 실질 내로 이주 있도록 그들의 내피 counterreceptors, 예를 들면 VCAM-I (혈관 세포 부착 분자), ICAM-I (간 부착 분자)를 결합함으로써 밀착성을 매개한다. 이들 및 다른 연구 결과는 면역 세포의 이동을 조절하는 내피 세포 자체의 적극적인 역할을 강조한다.
또한, BMECs NVU의 일부 뇌 혈류 리튬의 조절에 관여 된 바와지역 신경 세포의 신진 대사 요구에 nked. 성상 세포 자극시 내피 세포는 혈관 평활근 세포 (15)의 이완에 산화 질소로 혈관 활성 물질을 생산한다.
현상뿐만 아니라 성인 뇌 쇼 평행 패터닝 및 개발 및 규제 1,4 많은 속성을 공유하는 신생 혈관 형성 및 신경. 내피 세포는 비판적으로 이러한 프로세스 (16), (17)에 참여하고 있습니다.
요약하면, BMECs는 CNS의 적절한 개발과 기능을 보장하기 위해 필수적인 기능을 제공합니다. BBB 장애는 많은 심각한 신경 학적 장애에 연결되어 있습니다. 그러나, 매우 소수의 대상은 특정하고 효율적인 치료 18 뇌 혈관계 계면에서 확인되었다. 시험 관내 모델에서 간소화가 싸다 대한 함수 복잡한 생리 학적 시스템의 조절에 관여하는 메커니즘을 이해하는 데 사용되어왔다NG 시간. 이 원고와 쥐의 BMECs의 체외 연구에 의해 설명 된 특정 마우스 녹아웃-균주의 다양한 주어진 격리, 새로운 치료 길을 열어 생리 학적 및 병태 생리 학적 조건에서 BBB 기능 및 규제의 또 다른 이해를 제공 할 수 있습니다.
혈액 – 뇌 장벽 기능 장애는 다발성 경화증의 BBB의 예를 들어 고장 광범위자가 반응 면역 세포에 의한 중추 신경계의 침략을 용이하게하고 희소 돌기 아교 세포의 만남과 파괴를 가능하게 다양한 해로운 CNS 질환의 특징이다. 허혈성 뇌졸중에서 BBB의 중단과 뇌 부종의 후속 형성 보조 경색의 성장과 환자 6의 생존율에 영향을 미치는 중요한 요소이다. 나아가, 원격지에서 BBB의 변화에 의해 국소 허혈성 뇌 병변의 광범위한 기능적 변화를 유도 할 수있다. 그러나, 기본 분자 메커니즘은 5 크게 알려져 있지 않다. 반면에, 기능 BMECs에서 높은 밀도와 유출 수송의 다양성은 감염성 질환에 대한 뇌의 악성 종양 또는 항생제 화학 요법으로 도움이 약물의 농도를 감소시킨다. 따라서, 뇌 혈관 바의 깊은 이해생리 학적 및 병태 생리 학적 조건 하에서는 캐리어 기능은 특히 선호 방향 (21)에 장벽 기능을 조절 할 수있는 약리학 적 제제를 개발하는 것이 요구된다. BBB의 체외 모델에서 신뢰성이 BBB에서 규제 메커니즘을 연구하기 위해 필수 불가결 한 도구입니다.
많은 불사 화 뇌 내피 세포주 확립 및 체외 BBB 모델 (22)로서 사용되어왔다. 그들은 빠르게 성장하고 여러 통로를 통해 특정 BBB 특성을 유지 이들 세포주는 차 BMECs을 통해 어떤 이점을 제공합니다. 그러나 내피 세포 라인은 완전히 생체 내 상황에 대한 실험 결과의 양도와 섞이는 등의 중요한 속성이 변경 일차 전지를 대체 할 수 없습니다. 예를 들어, 뮤린 뇌 내피 세포주 bEnd.5 높은 parac 선도 불연속 분산 꽉 접합 단백질 만 낮은 수준을 발현ellular 투과성 (23). BEnd.3 다른 자주 사용되는 뮤린 뇌 내피 세포주, 치밀하고 연속 분산 견고 연접, 높은 저항 transendothelial 여러 유출 수송차와 낮은 세포층 투과성을 보여준다. 일차 BMECs 특정 세포 횡단 및 세포층의 기판 (24)의 투과에 대하여 실제 차별 부족하지만 bEND.3 셀 층 비해.
차 세포 배양의 준비에서 오염 세포는 크게 실험 결과의 타당성을 방해 할 수 있습니다. 내피 세포는 높은 순도를 달성하기 위해 기술 된 프로토콜에 pyrumicin은 선택적 제로서 사용된다. 그럼에도 불구하고, 세포 배양의 일반적인 품질 관리 불가피 신뢰성 실험 보장하는데 필요하다. 내피 세포의 전형적인 형태 학적 특성 (도 1a 참조), transendothelia 게다가 품질 제어를위한 여러 가지 방법이있다L 저항을 측정 할 수있는 또는 같은 CD31와 같은 내피 세포 마커의 발현 (그림 1B 참조) 또는 폰 빌레 브란트 인자 (vWF의)가 평가 될 수 있습니다.
한 마우스 뇌로부터 단리 뇌 내피 세포의 수가 상대적으로 낮은 여러 실험에 적합한 세포 배양을 설정하는 등의 여러 쥐의 뇌를 풀링 할 수있다. 우리의 경험에서, 적어도 10 마우스는 각 동물 시설의 자원에 따라 제한적인 요소가 될 수있는 하나의 실험을 위해 사용되어야한다. 바이어스 또는 교란 요인을 피하기 위해, 동일한 유전 적 및 환경 적 배경 만 마우스 풀링한다. 반대로, 소 및 돼지의 뇌 내피 세포 제제는 하나의 뇌에서 사용할 뇌 내피 세포의 다수를 제공한다. 그러나, 복잡하지 않은 번식과 주택, 가능한 형질 전환 마우스의 광범위하고 계속 증가하는 레퍼토리 외에 주 쥐 BMECs 이상적인로 렌더링모델은 혈액 – 뇌 장벽의 기능을 연구합니다.
BBB 및 기본 분자 메커니즘의 기능에 관한 몇 가지 주요 연구 결과는 2 차원 조직 배양 시스템의 연구에서왔다. 최근, 3 차원 배양 시스템은 내피 세포 루멘 관 네트워크를 형성 할 수 있도록 콜라겐 매트릭스 내에 배치된다 (25)이 개발되어왔다. 이러한 새로운 세포 배양 시스템은 생체 내에서 혈관 손상 유기체 프로세스 더욱 정확한 재생산을 허용. 이러한 혈관 주위 세포와 성상 세포로 NVU 3 차원 세포 배양 시스템의 추가 세포의 참여는 혈액 – 뇌 장벽 기능의 공부 체외 혁명 있습니다; 제 모델은 최근 26 개발되었다.
문제 해결을위한 몇 가지 권장 사항이 있습니다. 모든 멸균 작업의 첫 번째는 내피 세포 배양의 품질에 필수적이다. 둘째, pyrumycin는 셀을 추가해야합니다배양의 처음 2 일 내에 사용되는 배지는, 응용 프로그램은 더 이상 증가 MBMEC 세포 사멸과 낮은 품질의 장벽 기능을 초래할 수있다. 셋째,이 프로토콜에 적용될 효소 제조업체의 지시에 따라 사용 및 저장되어야한다; 그렇지 않으면 자신의 적절한 기능이 손상 될 수 있습니다. 내피 세포 부착하지 않는 경우 또한, 세포 배양 판의 코팅은 개정 될 수 있습니다. 피브로넥틴 및 콜라겐의 농도가 변경되게 또는 다른 기질 단백질이 코팅 용액에 첨가 될 수있다. 마지막으로, 연령, 성별, 동물 시설 내의 연도와 환경 조건의 계절 MBMEC 분리 실험의 비교의 품질에 영향을 줄 수있는 중요한 인자이다. 이 조건이 독립적 인 실험과 비교할 수 있는지를 확인해야한다.
기술 된 프로토콜은 뮤린 BMECs을 분리하는 기본적인 neuroimmunological 방법으로 고려되어야한다. 분리 된 세포는 U이 될 수 있습니다이러한 마이그레이션 분석법, 유전자 및 단백질 발현 연구, 또는 전기 생리 학적 평가 투과성 실험 등 BBB 기능에 추가 통찰력을 얻기 위해 다양한 애플리케이션을위한 나오지. 전술 한 바와 같이, 3D BMECs의 세포 배양 시스템은 NVU의 맥락에서 BBB의 조절에 관여 복잡한 메커니즘을 연구하기위한 새로운 기회를 제공 할 수있다. 따라서, 차 내피 세포의 분리는 향후 BBB 연구 분야에서 매우 중요한 기술에 남아있을 것이다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 독일 연구 협회 임상 연구 (IZKF) 뮌스터에 대한 학제 간 센터 (SEED 3월 12일, SB), (DFG)에 의해 지원되었다, 셀 – 인 – 모션 우수 클러스터 (EXC 1003 – CIM), 뮌스터 대학 (SB 및 SGM에)와 그렇지 크로네-는 Fresenius 재단 (SB 및 SGM에 2012_A88)에 의해. 우리는 우수한 삽화 헤이 케 블룸 감사합니다.
bFGF | Peprotech | 100-18B | Basic fibroblast growth factor |
BSA | Sigma Aldrich | A9418 | Bovine serum albumine |
Collagenase CLS2 | Worthington | LS004176 | High relative level of protease activity |
Collagenase-dispase | Roche | 10269638001 | Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa |
Collagen IV | Sigma Aldrich | C0543 | From Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane |
DMEM | Sigma Aldrich | D5030 | Warm in 37 °C water bath before use |
DNAse | Sigma Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas |
FCS | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal calf serum (also named fetal bovine serum) |
Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | Anticoagulant |
PDS | First Link UK Ltd. | 60-00-850 | Plasma-derived serum |
Percoll | Sigma Aldrich | P1644 | Warm to room temperature before use |
Pyrumycin | Sigma Aldrich | P8833 | Should only be used in first 2 d of culture |