Whole-Mount-Imaging von Mouse Embryo Sinnes Axon Projektionen
Summary
We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.
Abstract
Die Visualisierung der in voller Länge neuronalen Projektionen in Embryonen ist wesentlich für ein Verständnis, wie Säugetier neuronale Netze entwickeln zu gewinnen. Hier beschreiben wir eine Methode, um in situ zu markieren eine Teilmenge der Hinterwurzelganglien (DRG) Axon ihrer phänotypischen Eigenschaften beurteilen mit mehreren genetisch manipulierte Mauslinien. Die TrkA-positive Neurone nociceptor Neuronen, für die Übertragung von Schmerzsignalen gewidmet. Wir nutzen eine TrkA taulacZ Mauslinie, die Flugbahnen aller TrkA-positiven peripheren Axonen im intakten Mausembryo zu kennzeichnen. Wir züchten ferner den TrkA taulacZ Schnur auf eine Bax null Hintergrund, die im Wesentlichen aufhebt neuronale Apoptose, um wachstumsbedingte stellen unabhängig von möglichen Wirkungen von genetischen Manipulationen auf das neuronale Überleben zu beurteilen. Anschließend werden gentechnisch veränderte Mäuse von Interesse mit der TrkA Taul gezüchtetlacZ / Bax Nulllinie und sind dann bereit für die Studie unter Verwendung der hierin beschriebenen Techniken. Diese Präsentation enthält detaillierte Informationen über Maus Zuchtpläne, Genotypisierung bei der Dissektion, Gewebevorbereitung, Färbung und Clearing zur Visualisierung von voller Länge axonalen Bahnen ganz-mount Vorbereitung zu ermöglichen.
Introduction
Gründung der genauen neuronalen Netzen ist eine komplexe Entwicklungsprozess wesentlich für die Funktion des Nervensystems. Störung in diesem Verfahren führt zu neuronalen Funktionsstörungen, die in menschlichen neurologischen Erkrankungen 1-3 gebracht wurde. Um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der Axon Wachstum und Ziel Innervation bei Säugetieren zu untersuchen, haben wir ein Protokoll, um die axonalen Bahnen der TrkA-exprimierenden sensorischen Neuronen mit einer Kombination von zwei genetisch veränderten Mauslinien zu visualisieren entwickelt.
TrkA ist ein Rezeptor für den Nervenwachstumsfaktor NGF und ein Funktionsmarker nozizeptiven sensorischen Neuronen 4. TrkA ist stark in nozizeptiven Neuronen während der frühen Entwicklung ausgedrückt und vermittelt NGF-abhängige Überleben von Neuronen, das Wachstum von Axonen, Verzweigung und Ziel Innervation 5-9. In TrkA taulacZ Mäusen wird die Wildtyp-TrkA-Gen von einem taulacZ Ausdruck c ersetztassette 10, derart, dass die axonale Morphologie putative TrkA-positive Neurone kann durch β-Gal (X-gal) Anfärben 11 visualisiert werden. Mit einem heterozygot TrkA taulacZ / WZ-Linie, können wir Faktoren, die zu regulieren oder zu stören die Entwicklung der sensorischen afferenten Projektionen in vivo kann zu untersuchen.
Außerdem ist TrkA Expression in homozygoten TrkA taulacZ / taulacZ Mäusen, die daher verwendet werden können, um das Wachstum der Axone zu fördern Mechanismen in Abwesenheit von NGF / TrkA Signalisierungs beurteilen abwesend. Seit nozizeptiven Neuronen hängt von NGF / TrkA Signalisierung nicht nur für das Wachstum von Axonen, sondern auch für das Überleben, setzen wir einen weiteren Mauslinie, ohne die pro-apoptotische Bax-Gens, die Apoptose in embryonalen DRG-Neuronen hemmen, retten sie vor Zelltod, die sonst ist in Abwesenheit von TrkA Signalisierungs beobachtet. Das Bax – / – Hintergrund 12 ermöglicht somit die Molekular Dissektion von Signalwegen, die speziell beeinflussen Axonwachstum 7-9,13-15. In TrkA – / -: Bax – / – Mäuse, DRG-Neuronen überleben, aber sensorischen afferenten Innervation der Haut vollständig abgeschafft 14,15. Wir können selektiv aktiviert Signalwege auf ihre jeweiligen Beiträge zur Entwicklung von Axon Projektionen zu bestimmen. Der Nutzen dieser Methode ist, dass sie die Beurteilung der Änderungen im Wachstum der Nervenfasern Phänotypen, wenn verschiedene genetische Veränderungen werden auf die TrkA taulacZ / taulacZ gezüchtet: Bax – / – oder TrkA taulacZ / WT: Bax – / – Hintergründe.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die oben beschriebene X-gal Färbeverfahren embryonaler TrkA taulacZ Mäusen erlaubt die schnelle und präzise Visualisierung Fern Axon in der intakten Fest Embryo. Aufgrund der Bax null Hintergrund diese Mäuse ermöglichen die Untersuchung von Signalmechanismen, die sowohl Axon Wachstum und Überleben von Neuronen beitragen können. Paarung mit transgenen oder Knockout-Mäuse von Interesse ermöglicht die umfassende Beurteilung der axonalen Phänotypen und kann als nützlicher Leitfaden f?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Louis Reichardt für die TrkA taulacZ Mäusen und Dr. Annette Markus für aufschlussreiche Diskussionen und Anregungen. Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem Startup-Burke-Stiftung sowie Whitehall-Stiftung Forschungsstipendium 2010-08-61, ein Forschungsstipendium von Wings for Life Foundation (WFL-US-028/14) unterstützt wird, gewähren ZB1-1102-1 von der Christopher & Dana Reeve Foundation, und Zuschüsse 1R01EY022409 und 3R01EY022409-01S1 vom National Eye Institute, zu JZ. KJO ist ein Goldsmith Kerl.
Materials
| Company | Catalog Number | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6418 |
| PBS | Life Tech | 10010-023 |
| Tissue Rinse Solution A | Millipore | BG-6-B |
| Tissue Rinse Solution B | Millipore | BG-7-B |
| Tissue Stain Base Solution | Millipore | BG-8-C |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 |
| Glass scintiallation vial | Kimble Chase | 74500-20 |
| Incubator | Labline | Model 120 |
| Insect pins | FST | 26000-30 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 |
| 6 well dish | USA Scientific | CC7672-7506 |
| Primers | IDT | custom DNA primers |
| Takara dNTP mixture | Takara | 4030 |
| Takara LA buffer | Takara | RR002A |
| Takara LA Taq | Takara | RR002A |
| PCR machine | Bio-Rad | DNA Engine Dyad |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | B-1042 |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B-6630 |
| Dissecting microscope | Leica | M205A |
| Camera | Leica | DFC310FX |
| Ring light | Leica | MEB110 |
| Photoshop | Adobe | Photoshop 4.0 |
References
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