माउस भ्रूण संवेदी अक्षतंतु अनुमानों के पूरे माउंट इमेजिंग
Summary
We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.
Abstract
भ्रूण में पूर्ण लंबाई न्यूरोनल अनुमानों के दृश्य neuronal नेटवर्क का विकास कैसे स्तनधारी की समझ हासिल करने के लिए आवश्यक है। यहाँ हम बगल में कई आनुवंशिक रूप से चालाकी से माउस लाइनों का उपयोग कर अपने प्ररूपी विशेषताओं का आकलन करने के लिए पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि (DRG) अक्षतंतु अनुमानों के एक सबसेट लेबल करने के लिए एक विधि का वर्णन। TrkA पॉजिटिव न्यूरॉन्स दर्द संकेतों के प्रसारण के लिए समर्पित nociceptor न्यूरॉन्स, कर रहे हैं। हम बरकरार माउस भ्रूण में सभी TrkA पॉजिटिव परिधीय axons की trajectories के लेबल करने के लिए एक TrkA taulacZ माउस लाइन का उपयोग। हम आगे के लिए स्वतंत्र रूप न्यूरोनल अस्तित्व पर आनुवंशिक जोड़तोड़ के संभावित प्रभावों के विकास से संबंधित सवालों का आकलन करने के क्रम में, अनिवार्य रूप से न्यूरोनल apoptosis को समाप्त करता है, जो एक Bax अशक्त पृष्ठभूमि, पर TrkA taulacZ लाइन नस्ल। बाद में, ब्याज की आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों TrkA taul के साथ पैदा कर रहे हैंacZ / Bax अशक्त लाइन और फिर इस के साथ साथ वर्णित तकनीकों का उपयोग करते हुए अध्ययन के लिए तैयार कर रहे हैं। इस प्रस्तुति पूरे माउंट तैयारी में पूर्ण लंबाई axonal trajectories के दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए विच्छेदन, ऊतक तैयारी, धुंधला और समाशोधन के समय में विस्तृत माउस प्रजनन योजनाओं के बारे में जानकारी, जीनोटाइपिंग भी शामिल है।
Introduction
सटीक neuronal नेटवर्क की स्थापना के तंत्रिका तंत्र की कार्यक्षमता के लिए आवश्यक एक जटिल विकास की प्रक्रिया है। इस प्रक्रिया में अशांति मानव मस्तिष्क संबंधी बीमारियों 1-3 में फंसा दिया गया है जो न्यूरोनल में शिथिलता की ओर जाता है। स्तनधारियों में अक्षतंतु विकास और लक्ष्य स्फूर्तिदान की अंतर्निहित आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए, हम दो आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस लाइनों के संयोजन का उपयोग संवेदी न्यूरॉन्स TrkA व्यक्त की axonal trajectories कल्पना करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है।
TrkA तंत्रिका वृद्धि कारक NGF के लिए एक रिसेप्टर है और nociceptive संवेदी न्यूरॉन्स 4 के एक कार्यात्मक मार्कर है। TrkA अत्यधिक जल्दी विकास के दौरान nociceptive न्यूरॉन्स में व्यक्त किया और NGF निर्भर न्यूरॉन अस्तित्व, अक्षतंतु विकास, द्रुमायण और लक्ष्य स्फूर्तिदान 5-9 मध्यस्थता कर रहा है। TrkA taulacZ चूहों में, जंगली प्रकार TrkA जीन एक taulacZ अभिव्यक्ति सी द्वारा बदल दिया हैख्यात TrkA पॉजिटिव न्यूरॉन्स की axonal आकृति विज्ञान 11 धुंधला β-लड़की (एक्स-लड़की) द्वारा देखे जा सकते हैं कि इस तरह के assette 10,। एक विषमयुग्मजी TrkA taulacZ / गुम्मट लाइन का उपयोग करना, हम विनियमित या विवो में संवेदी अभिवाही अनुमानों के विकास के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं कि कारकों की जांच कर सकते हैं।
इसके अलावा, TrkA अभिव्यक्ति इसलिए NGF / TrkA संकेतन के अभाव में तंत्र को बढ़ावा देने के अक्षतंतु विकास का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो समयुग्मक TrkA taulacZ / taulacZ चूहों में अनुपस्थित है। Nociceptive न्यूरॉन्स NGF / TrkA न केवल अक्षतंतु विकास के लिए संकेत पर निर्भर करती है के बाद से, लेकिन यह भी अस्तित्व के लिए, हम अन्यथा यह है कि कोशिका मृत्यु से उन्हें बचाव, भ्रूण DRG न्यूरॉन्स में apoptosis को बाधित करने के लिए, समर्थक apoptotic Bax जीन की कमी, एक और माउस लाइन को रोजगार TrkA संकेतन के अभाव में मनाया। Bax – / – पृष्ठभूमि 12 इस प्रकार molecu के लिए अनुमति देता हैविशेष रूप से अक्षतंतु विकास 7-9,13-15 को प्रभावित करने वाले रास्ते संकेतन के LAR विच्छेदन। TrkA में – / -: Bax – / – चूहों, DRG न्यूरॉन्स जीवित है, लेकिन त्वचा में संवेदी अभिवाही तंत्रिका वितरण पूरी तरह से 14,15 को समाप्त कर दिया गया है। हम चुनिंदा अक्षतंतु अनुमानों के विकास के लिए उनके संबंधित योगदान निर्धारित करने के लिए रास्ते संकेतन सक्रिय कर सकते हैं। इस पद्धति की उपयोगिता विभिन्न आनुवंशिक संशोधनों TrkA taulacZ / taulacZ पर पैदा कर रहे हैं जब यह axonal विकास phenotypes में परिवर्तन का आकलन है कि अनुमति देता है: Bax – / – या TrkA taulacZ / गुम्मट: Bax – / – पृष्ठभूमि।
Protocol
Representative Results
Discussion
भ्रूण TrkA taulacZ चूहों के ऊपर वर्णित एक्स-लड़की धुंधला प्रक्रिया बरकरार तय भ्रूण में लंबी दूरी की अक्षतंतु अनुमानों के तेजी से और विस्तृत दृश्य के लिए अनुमति देता है। इन चूहों अक्षतंतु विकास और neuronal ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों व्यावहारिक चर्चा और सुझावों के लिए TrkA taulacZ चूहों और डॉ एनेट मार्कस के लिए डॉ लुई Reichardt को धन्यवाद देना चाहूंगा। इस काम बर्क फाउंडेशन के रूप में अच्छी तरह से व्हाइटहॉल फाउंडेशन अनुसंधान अनुदान 2010-08-61, जीवन फाउंडेशन (WFL-अमेरिका-028/14) के लिए पंखों से एक शोध अनुदान से स्टार्टअप धन के द्वारा समर्थित किया गया था, से ZB1-1102-1 अनुदान क्रिस्टोफर और दाना रीव फाउंडेशन, और JZ को राष्ट्रीय नेत्र संस्थान से अनुदान 1R01EY022409 और 3R01EY022409-01S1,। KJO एक सुनार साथी है।
Materials
| Company | Catalog Number | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6418 |
| PBS | Life Tech | 10010-023 |
| Tissue Rinse Solution A | Millipore | BG-6-B |
| Tissue Rinse Solution B | Millipore | BG-7-B |
| Tissue Stain Base Solution | Millipore | BG-8-C |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 |
| Glass scintiallation vial | Kimble Chase | 74500-20 |
| Incubator | Labline | Model 120 |
| Insect pins | FST | 26000-30 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 |
| 6 well dish | USA Scientific | CC7672-7506 |
| Primers | IDT | custom DNA primers |
| Takara dNTP mixture | Takara | 4030 |
| Takara LA buffer | Takara | RR002A |
| Takara LA Taq | Takara | RR002A |
| PCR machine | Bio-Rad | DNA Engine Dyad |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | B-1042 |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B-6630 |
| Dissecting microscope | Leica | M205A |
| Camera | Leica | DFC310FX |
| Ring light | Leica | MEB110 |
| Photoshop | Adobe | Photoshop 4.0 |
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