Hela-mount avbildning av Mouse Embryo Sensorisk Axon Projektioner
Summary
We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.
Abstract
Visualiseringen av fullängds neuronala prognoser i embryon är viktigt att få en förståelse för hur däggdjur neuronala nätverk utvecklas. Här beskriver vi en metod för att märka på plats en delmängd av dorsala ganglion (DRG) axon prognoser för att bedöma sina fenotypiska egenskaper med hjälp av flera genmanipulerade mus linjer. TrkA-positiva neuroner är Nociceptor neuroner, tillägnad överföringen av smärtsignaler. Vi använder ett TrkA taulacZ mus linje att märka banor alla TrkA- positiva perifera axoner i intakta musen embryot. Vi föder ytterligare TrkA taulacZ linjen på en Bax null bakgrund, som i huvudsak upphäver neuronal apoptos, i syfte att bedöma tillväxtrelaterade frågor oberoende av eventuella effekter av genetiska manipulationer på neuronal överlevnad. Därefter är genetiskt modifierade möss av intresse uppvuxna med TrkA TaulACZ / Bax null linje och är sedan redo för studie med de tekniker som beskrivs häri. Presentationen innehåller detaljerad information om mus avelsplaner, genotypning vid tidpunkten för dissektion, förberedelse vävnad, färgning och clearing för att möjliggöra visualisering av full längd axonal banor i hela montering förberedelser.
Introduction
Etablering av exakta neuronala nät är en komplex utvecklingsprocess väsentligt för funktionaliteten av nervsystemet. Störningar i denna process leder till neuronal dysfunktion som har varit inblandad i humana neurologiska sjukdomar 1-3. För att studera de bakomliggande molekylära mekanismer axontillväxt och mål innervation hos däggdjur, har vi utvecklat ett protokoll för att visualisera axonal banor TrkA-uttryck sensoriska neuroner med en kombination av två genetiskt modifierade mus linjer.
TrkA är en receptor för nervtillväxtfaktorn NGF och är en funktionell markör för nociceptiva sensoriska neuroner 4. TrkA starkt uttryck i nociceptiva neuroner under tidig utveckling och förmedlar NGF-beroende neuron överlevnad, axontillväxt, arborization och mål innervation 5-9. I TrkA taulacZ möss, är den vilda typen TrkA-genen ersatt av en taulacZ uttrycks cassette 10, så att den axonal morfologi av förmodade TrkA-positiva neuroner kan visualiseras genom β-gal (X-gal) färgning 11. Med hjälp av en heterozygot TrkA taulacZ / WT linje, kan vi undersöka faktorer som kan reglera eller störa utvecklingen av sensoriska afferenta prognoser in vivo.
Dessutom är TrkA uttryck frånvarande i homozygota TrkA taulacZ / taulacZ möss, som därför kan användas för att bedöma axontillväxt främja mekanismer i frånvaro av NGF / TrkA signalering. Eftersom nociceptiva neuroner beroende NGF / TrkA signalering inte bara för Axon tillväxt, men också för att överleva, vi sysselsätter annan mus linje, saknar den pro-apoptotiska Bax genen, att hämma apoptos i embryonala DRG nervceller, rädda dem från celldöd som annars observerats i frånvaro av TrkA signalering. Den Bax – / – bakgrunds 12 möjliggör därmed för molecular dissekering av signalvägar som specifikt drabbar axontillväxt 7-9,13-15. I TrkA – / -: Bax – / – möss, DRG nervceller överlever, men sensoriska afferenta innervation i huden är helt avskaffade 14,15. Vi kan selektivt aktivera signalvägar för att fastställa sina respektive bidrag till utvecklingen av Axon prognoser. Nyttan av denna metod är att den tillåter en bedömning av förändringar i axonal tillväxt fenotyper när olika genetiska modifieringar föds på TrkA taulacZ / taulacZ: Bax – / – eller TrkA taulacZ / WT: Bax – / – bakgrunder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den ovan beskrivna X-gal färgningsprocedur av embryonala TrkA taulacZ möss möjliggör snabb och detaljerad visualisering av långväga axon prognoser i intakta fasta embryot. På grund av Bax null bakgrunden dessa möss möjliggöra sondering av signalering mekanismer som kan bidra till både axontillväxt och neuronal överlevnad. Parning med transgena eller knockout-möss av intresse möjliggör omfattande bedömning av axonal fenotyper och kan tjäna som användbar guide för framtida …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Dr Louis Reichardt för TrkA taulacZ möss och Dr Annette Markus för insikts diskussion och förslag. Detta arbete stöddes av start medel från Burke Foundation samt Whitehall Foundation forskningsanslag 2010-08-61, ett forskningsanslag från Wings for Life Foundation (WFL-US-028/14), bevilja ZB1-1102-1 från Christopher & Dana Reeve Foundation och bidrag 1R01EY022409 och 3R01EY022409-01S1 från National Eye Institute, till JZ. KJO är en guldsmed karl.
Materials
| Company | Catalog Number | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6418 |
| PBS | Life Tech | 10010-023 |
| Tissue Rinse Solution A | Millipore | BG-6-B |
| Tissue Rinse Solution B | Millipore | BG-7-B |
| Tissue Stain Base Solution | Millipore | BG-8-C |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 |
| Glass scintiallation vial | Kimble Chase | 74500-20 |
| Incubator | Labline | Model 120 |
| Insect pins | FST | 26000-30 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 |
| 6 well dish | USA Scientific | CC7672-7506 |
| Primers | IDT | custom DNA primers |
| Takara dNTP mixture | Takara | 4030 |
| Takara LA buffer | Takara | RR002A |
| Takara LA Taq | Takara | RR002A |
| PCR machine | Bio-Rad | DNA Engine Dyad |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | B-1042 |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B-6630 |
| Dissecting microscope | Leica | M205A |
| Camera | Leica | DFC310FX |
| Ring light | Leica | MEB110 |
| Photoshop | Adobe | Photoshop 4.0 |
References
- Verze, L., et al. Cutaneous innervation in hereditary sensory and autonomic neuropathy type IV. Neurology. 55, 126-128 (2000).
- Sethna, N. F., Meier, P. M., Zurakowski, D., Berde, C. B. Cutaneous sensory abnormalities in children and adolescents with complex regional pain syndromes. Pain. 131, 153-161 (2007).
- Uceyler, N., et al. Small fibers in Fabry disease: baseline and follow-up data under enzyme replacement therapy. J Peripher Nerv Syst. 16, 304-314 (2011).
- Reichardt, L. F., Mobley, W. C. Going the distance, or not, with neurotrophin signals. Cell. 118, 141-143 (2004).
- White, F. A., et al. Synchronous onset of NGF and TrkA survival dependence in developing dorsal root ganglia. J Neurosci. 16, 4662-4672 (1996).
- Farinas, I., Wilkinson, G. A., Backus, C., Reichardt, L. F., Patapoutian, A. Characterization of neurotrophin and Trk receptor functions in developing sensory ganglia: direct NT-3 activation of TrkB neurons in vivo. Neuron. 21, 325-334 (1998).
- Markus, A., Zhong, J., Snider, W. D. Raf and akt mediate distinct aspects of sensory axon growth. Neuron. 35, 65-76 (2002).
- Kuruvilla, R., et al. A neurotrophin signaling cascade coordinates sympathetic neuron development through differential control of TrkA trafficking and retrograde signaling. Cell. 118, 243-255 (2004).
- Zhong, J., et al. Raf kinase signaling functions in sensory neuron differentiation and axon growth in vivo. Nature. 10, 598-607 (2007).
- Bulfone, A., et al. An olfactory sensory map develops in the absence of normal projection neurons or GABAergic interneurons. Neuron. 21, 1273-1282 (1998).
- Moqrich, A., et al. Expressing TrkC from the TrkA locus causes a subset of dorsal root ganglia neurons to switch fate. Nature. 7, 812-818 (2004).
- Knudson, C. M., Tung, K. S., Tourtellotte, W. G., Brown, G. A., Korsmeyer, S. J. Bax-deficient mice with lymphoid hyperplasia and male germ cell death. Science. 270 (5233), 96-99 (1995).
- Lentz, S. I., Knudson, C. M., Korsmeyer, S. J., Snider, W. D. Neurotrophins support the development of diverse sensory axon morphologies. J. Neurosci. 19, 1038-1048 (1999).
- Patel, T. D., Jackman, A., Rice, F. L., Kucera, J., Snider, W. D. Development of sensory neurons in the absence of NGF/TrkA signaling in vivo. Neuron. 25, 345-357 (2000).
- Donovan, K. J., et al. B-RAF kinase drives developmental axon growth and promotes axon regeneration in the injured mature CNS. The Journal of experimental medicine. 211, 801-814 (2014).
- Mercer, K., et al. Expression of endogenous oncogenic V600EB-raf induces proliferation and developmental defects in mice and transformation of primary fibroblasts. Cancer research. 65, 11493-11500 (2005).
- Tronche, F., et al. Disruption of the glucocorticoid receptor gene in the nervous system results in reduced anxiety. Nature genetics. 23, 99-103 (1999).
- Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).
- Feng, G., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Schmidt, H., Rathjen, F. G. DiI-labeling of DRG neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord. J Vis Exp. , (2011).
