Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).
Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein’s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.
Las redes de interacción de proteínas (PIN) ofrecen un mapa de baja resolución de cómo las proteínas se organizan funcionalmente en la celda 1. Cada conexión física entre dos proteínas, o la interacción proteína-proteína (PPI), pueden representar una asociación que es estable en el tiempo, tales como las que se encuentran dentro de los complejos de proteínas y que contribuyen a la organización estructural de la célula. Estas conexiones también pueden representar asociaciones transitorias que regulan la actividad, la estabilidad, la localización y la interacción de los dos socios. La identificación de los socios de la interacción física de una determinada proteína, por tanto, ofrece amplia información sobre la función y regulación de esa proteína 2,3. Por estas razones, grandes esfuerzos se han puesto hacia el mapeo de PINs en organismos modelo, incluyendo Escherichia coli 4-6, Arabidopsis thaliana 7, Saccharomyces cerevisiae 8-12, Drosophila melanogaster </ Em> 13, Caenorhabditis elegans 14 y 15 Homo Sapiens. Estos estudios han proporcionado información importante sobre cómo se organizan las proteínas en la célula y por lo tanto la información clave sobre las proteínas con funciones anteriormente desconocidas.
Varias estrategias se han desarrollado a lo largo de los años para estudiar los PIN. Estas tecnologías se pueden agrupar en términos generales en tres categorías basadas en el tipo de información que proporcionan sobre los IBP (revisado en 16 a 18). El primero de ellos se basa en dos híbridos de levadura y sus derivados 19. Estas tecnologías proporcionan información sobre la asociación directa entre pares de proteínas, lo que permite la construcción de redes binarias. La segunda familia se basa en la purificación por afinidad de proteínas cebo y la identificación de sus socios asociados, tales como la purificación por afinidad seguido de espectrometría de masas 20. Estos enfoques identifican grupos de proteínas que son directamenteo indirectamente asociado, en general, de una manera estable, y son extremadamente poderosa para identificar los complejos de proteínas. El tercer enfoque se basa en ensayos de complementación de proteínas fragmento (ACC) 11,21. Este enfoque proporciona un nivel intermedio de resolución entre los dos enfoques anteriores, ya que permite la detección de asociaciones directas y proximal entre proteínas. Cada técnica tiene sus propias fortalezas y debilidades, como recientemente revisado 18.
El PIN eucariota mejor descrito es de lejos la una de la levadura Saccharomyces cerevisiae en ciernes, en parte debido a su proteoma es relativamente menos complejas que las de otros eucariotas modelo y porque ensayos de alto rendimiento para detectar los IBP primero se han ensayado y es más eficiente implementado en este organismo modelo 9-12. Un método particularmente potente para el sistema de levadura es la dihidrofolato reductasa ensayo de complementación fragmento de proteína (DHFR-PCA), un ensayo que ha sidoutilizado en diferentes contextos para estudiar el PIN levadura en condiciones estándar y perturbados 11,22-26. Este método se basa en un ensayo de supervivencia que permite la detección de los IBP directos y cerca-directos para una proteína cebo dado en ambos niveles de expresión endógenos y localizaciones subcelulares nativos de las parejas de interacción 11,21 de una manera cuantitativa 27. La señal obtenida utilizando este ensayo (es decir, tamaño de la colonia en matrices de colonias de alta densidad) por lo tanto refleja la cantidad de complejos de proteínas formadas entre el cebo y presa en un entorno celular casi equivalente a la de las células de tipo salvaje. El ensayo se basa en la reconstitución de una enzima informadora involucrado en el metabolismo del folato, la dihidrofolato reductasa (DHFR), por el que dos fragmentos complementarios de la DHFR que se fusionan a las dos proteínas de interés se ponen en proximidad cuando las dos proteínas interactúan, que a su vez conduce a la reconstitución reversible de la actividad de la enzima 11 y el crecimiento de la cepa en un medio que contiene metotrexato (MTX; Figura 1). Este compuesto inhibe la enzima DHFR endógena, pero no el mutado utilizado en el ensayo 28. Dos colecciones de cepas de PCA, uno que contiene ~ 4300 MATa cepas con un ORF fusionado al DHFR F [1,2] fragmento y una que contiene ~ 4800 MAT α cepas con un ORF fusionado al [3] fragmento DHFR, se pueden comprar a implementar DHFR-PCA en pequeña o gran escala en cualquier laboratorio. Aquí se describe un protocolo general pero detallada para la detección de los IBP entre una proteína cebo y ~ 4.800 presa proteínas utilizando este ensayo.
Se describe un protocolo basado en el ensayo de DHFR-PCA permite la identificación sistemática de interactores físicas para cualquier cebo de proteína dada en alto rendimiento. Este protocolo se puede adaptar mediante el cribado para más cebos, y esto en cualquier nivel deseado de replicación. Se demuestra la fiabilidad de este protocolo por la identificación de los socios de la interacción física para una proteína cebo involucrados en el complejo del poro nuclear: Nup82. Nuestro análisis permitió encontrar cinco interactores reportados previamente y uno interactor no notificados anteriormente (Figuras 3F y 3G), destacando la capacidad del método para estudiar la interactome proteína de levadura.
El protocolo descrito aquí incluye varios pasos críticos a los que el experimentador debe prestar atención. Recomendamos a 1) Asegúrese de que el DHFR cebo F [1,2] de fusión es correcta (Figura 1B); esto se puede lograr mediante la secuenciación de la construcción y measuring expresión de la proteína adecuada usando un anticuerpo anti-DHFR F [1,2] o anti-DHFR F [3] anticuerpo; 2) Antes de comenzar la pantalla, se recomienda verificar si cualquier cebo de interés exhibe interacciones promiscuos en pantallas de PCA. Esto se puede hacer mediante la realización de pantallas de control con cebos cruzados con el control L-DHFR apropiada o mediante apareamiento manualmente el cebo con el control L-DHFR apropiado y realizar un ensayo de crecimiento en medio MTX. 3) Las placas se deben verter el día antes de que se utilizan para que la humedad es óptimo para la adherencia de las células sobre la superficie del agar durante el proceso de impresión; 4) Fuente placas no deben utilizarse más de cuatro veces para transferir suficientes células en la placa de destino. Aumentar el número de copias de la placa de destino se puede hacer mediante etapas sucesivas de expansión (por ejemplo, 4 copias -> 16 copias -> 64 copias). Alternativamente, las células pueden ser recogidos en diferentes posiciones en el césped o en la colonia entre las diferentes rondas de replicación; 5) Si varios positions faltan después de la selección (s) diploide, asegúrese de que las placas de base no se usaron demasiadas veces en la etapa de apareamiento (pasos 4.5 a 4.7); 6) Asegúrese de que el medio MTX contiene todos los ingredientes esenciales en las concentraciones adecuadas. De hecho, si no hay crecimiento en absoluto se observa en el medio MTX, puede ser ya sea porque no hay interacción es detectable por PCA para las proteínas de interés o porque el medio MTX no estaba preparado adecuadamente. Para asegurarse de que el medio permite el crecimiento de las cepas que muestran fragmentos de DHFR complementación, una interacción constitutiva se puede añadir en las posiciones vacías de la colección y se utiliza como un control positivo, tal como DHFR-fragmentos fusionados a restos de cremallera de leucina 33 (Figura 1C). Pruebas paralelas utilizando los fragmentos enlazador-DHFR o los fragmentos de la cremallera-enlazador-DHFR permitirá discriminar entre condiciones que permiten que todas las células crezcan (baja concentración de MTX o cebo de proteína que tienden a hacer que las interacciones positivas falsas, como described a continuación) y las condiciones que impiden el crecimiento de todas las cepas (ingrediente concentración de MTX demasiado alto o esencial que falta en el medio); 7) Dado que la PCA se lleva a cabo a través de rondas sucesivas de repeticiones de un medio a otro, la contaminación cruzada entre las cepas entre diferentes placas puede ocurrir si, por ejemplo, la herramienta pin no se esteriliza adecuadamente entre las rondas de replicación y / o el agua del último baño (es decir, la estación húmeda) en el procedimiento de esterilización está contaminada por colonias de rondas de replicación anteriores. Varias posiciones en las matrices están vacíos y por lo tanto se pueden utilizar como posiciones de control donde se debe observó crecimiento para detectar contaminaciones cruzadas.
Análisis de imágenes se puede realizar utilizando varios softwares publicados (véase la sección 5 del protocolo) o cualquier script personalizado. En este estudio, la secuencia de comandos personalizada ejecuta los siguientes pasos: 1) El guión resta valores de píxel de un plato vacío al píxel valores de cada placa con el fin de correct los sesgos de iluminación. 2) La secuencia de comandos convierte cada imagen de fondo con corrección a binario utilizando un umbral de valor de píxel de 10. 3) Por cada 1.536 posiciones de cada placa, determinados mediante la superposición de un rectángulo en las colonias de borde, el script se ejecuta ImageJ "Analizar partículas … "en función de una selección circular. La selección circular está configurado con un radio igual al intervalo entre dos posiciones menos 10 píxeles. 4) La secuencia de comandos selecciona la partícula más cercano del centro de la selección y la confirma como una colonia si su ubicación es no más de la mitad del intervalo entre dos colonias de distancia del centro de la selección. 5) El guión mide valores de píxeles de la partícula seleccionada en la imagen de fondo con corrección. 6) Para corregir además cualquier resto de sesgos de iluminación de fondo, el guión resta el valor medio de todos los píxeles de la selección circular que no formaban parte de una partícula a valores de píxeles de la colonia. La suma de estos valores de píxel corregidos, almacenados en la columna "IntDenBackSub" de la Tabla 1 complementario, se utilizan como medida del tamaño de la colonia.
Un paso crítico dentro de la parte de análisis es la elección del umbral de significación. Aquí, hemos elegido un umbral basado en la distribución de la negativa L-DHFR F [3] controles, pero dependiendo del objetivo de la pantalla, tal umbral puede ser demasiado estrictas. De hecho, L-DHFR F [3] controles se sobreexpresa (promotor fuerte TEF) de tal manera que los fragmentos complementarios pueden espontáneamente se complementan entre sí y por lo tanto éstos no son representativas de la expresión de la mayoría de las proteínas. Esto se pone de relieve por el hecho de que la distribución de la L-DHFR F [3] controles es más alto que el promedio de crecimiento de fondo (Figura 3D). Por lo tanto, algunas interacciones que tienen puntuaciones por debajo de este umbral estricto sino que están claramente fuera de la distribución del crecimiento fondo pueden ser considerados como éxitos supuestos que pueden representar, por ejemplo, entre transitoria o débilacciones. Estos se pueden estudiar más y validación cruzada si, por ejemplo, las dos proteínas no se expresan en niveles que pueden permitir la complementación espontánea de los fragmentos de DHFR como los controles de L-DHFR. Como alternativa, se podría establecer un umbral de significación basado en la proporción de superposición con interactores físicas reportadas en bases de datos como BIOGRID 35 a fin de maximizar la proporción de verdaderos positivos sobre falsos positivos. Sin embargo, a diferencia de la utilización de la distribución de L-DHFR, esta alternativa no siempre puede ser factible si, por ejemplo, el número de interactores físicos conocidos no es suficientemente alta. Además, la elección del umbral de significación tiene un impacto en la proporción de falsos positivos y falsos negativos en el conjunto de datos final. En efecto, como cualquier otro ensayo de detección de PPI, los falsos positivos pueden resultar de la interacción no específica de una proteína con la proteína DHFR-fusion si, por ejemplo, la proteína es muy abundante como se mencionó anteriormente. Estese ejemplifica por el hecho de que algunas presas interactúan sistemáticamente con todas las proteínas de cebo en las pantallas de PCA y, por tanto, necesitan ser retirados del análisis 11 (por ejemplo TIF2 y Ade17 y la Tabla complementaria 2). Para evitar este problema, una pantalla de PCA de control de las dos colecciones contra el control L-DHFR apropiado (F [1,2] o F [3]) para identificar cebos y presas que exhiben fragmentos de DHFR espontánea complementación se puede realizar en las condiciones específicas de cada pantalla. Por otra parte, la realización de un análisis de enriquecimiento de ontología de genes puede aumentar la confianza en los datos si se conoce la función de un cebo dado. Por otro lado, DHFR-PCA puede dar lugar a falsos negativos por varias razones: 1) no todas las proteínas se pueden fusionar a los fragmentos de DHFR ya que pueden desestabilizar las proteínas o modificar su localización si, por ejemplo, la fusión a la DHFR C-terminal interfiere con una señal de localización; 2) DHFR reconstitución en algunos compartimentos celulares may no producen folato si, por ejemplo, un precursor esencial para la síntesis de folato no está disponible; 3) C-termini necesidad de estar dentro de una distancia de 8 nm para DHFR complementación que se produzca 11. Por lo tanto, una interacción muy conocido no se puede detectar si su C-terminales no están lo suficientemente cerca en el espacio. Esto se ejemplifica aquí por el hecho de que una gran fracción de las interacciones físicas Nup82 reportadas en bases de datos, la mayoría de los cuales son indirecta, no se detectaron en nuestro ensayo. Del mismo modo, las interacciones entre proteínas de membrana para las que los extremos C-terminales están en trans con respecto a la membrana no darán lugar a fragmentos de DHFR complementación y no se detecta 11. Limitaciones 1) y 3) puede ser eludido de forma relativamente simple mediante la fusión del fragmento de DHFR a la N-terminales de la proteína. Hacerlo puede evitar interferir con una señal de localización, cerca de la C-terminal y puede permitir detectar una interacción entre las proteínas de membrana cuyo N y C-terminal son en relación cisa la membrana.
Varios desafíos permanecen en el estudio de PINs (revisado en 2,3). Los mapas de PINs producidos hasta ahora en gran parte se han descrito en una sola condición experimental para cada especie y así ofrecer una sola instantánea de cómo se podrían organizar redes de proteínas. Existe por tanto una necesidad para la exploración de las demás condiciones experimentales para ver cómo PINs pueden ser reorganizadas en respuesta a los cambios ambientales, estímulos específicos, a través de desarrollo o siguientes mutaciones. Estos retos se pueden superar mediante el desarrollo de nuevas tecnologías para interrogar a los IBP en tiempo real, en las células vivas y mediante la adaptación de las técnicas actuales para que puedan ser utilizados por una comunidad más amplia de laboratorios. Como técnica cuantitativa que puede detectar cambios en la cantidad de DHFR complementación complejos 27, DHFR-PCA se puede adaptar a superar estos retos y se ha utilizado para estudiar cómo los IBP se ven afectados por un ADN agente 22 dañar </sup>, agentes químicos 25, deleciones de genes 23,26 o en otras especies de levaduras y sus híbridos 33. Explorando estas nuevas dimensiones se hará más y más importante para revelar la dinámica del PIN.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Canadiense de Investigación en Salud (CIHR) Otorga 191.597, 299.432 y 324.265, una de Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de subvención Canadá Descubrimiento y una subvención Human Frontier Science Program de CRL. CRL es un CIHR Nueva Investigador. Guillaume Diss es apoyado por una beca PROTEO. Samuel Rochette es apoyado por NSERC y FRQNT becas.
Name of Material/Equipement | Company | Catalog Number | Comments/Description |
BioMatrix Robot, Bench-top Configuration | S&P Robotics Inc. | BM5-BC | |
96-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-96-10 | Standard 96-format Pin-tool with 96 high-precision floating pins |
384-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-384-10 | Standard 384-format Pin-tool with 384 high-precision floating pins |
1536-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-1536-05 | Custom 1536-format Pin-tool with 0.5mm high-precision floating pins |
Automated imaging module | S&P Robotics Inc. | IMG-02 | |
Methotrexate | Bioshop Canada Inc. | MTX440 | CAUTION: toxic compound |
Hygromycin B | Bioshop Canada Inc. | HYG003 | |
Nourseothricin dihydrogen sulfate | Werner BioAgents | 5010000 | |
Yeast-Interactome Collection | Thermo Scientific | YSC5849 | |
Omni Tray w/lid sterile | Thermo Scientific | 242811 | |
Anti-DHFR F[1,2] antibody | Sigma-Aldrich | D1067 | |
Anti-DHFR F[3] antibody | Sigma-Aldrich | D0942 |