Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).
Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein’s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.
Protein interaktionsnätverk (PIN) ger en låg upplösning karta över hur proteiner är funktionellt organiserade i cellen 1. Varje fysisk anslutning mellan två proteiner, eller protein-proteininteraktion (PPI), kan representera en förening som är stabil i tiden, såsom de som finns inom proteinkomplex och att bidra till den strukturella organisationen av cellen. Dessa anslutningar kan också representera transienta föreningar som reglerar verksamheten, stabilitet, lokalisering och interaktioner mellan de två parterna. Identifiera de fysiska interaktionspartner ett givet protein ger därför rik information om funktion och reglering av detta protein 2,3. Av dessa skäl har stora ansträngningar lagts mot kartläggning av koder i modellorganismer, inklusive Escherichia coli 4-6, Arabidopsis thaliana 7, Saccharomyces cerevisiae 8-12, Drosophila melanogaster </ Em> 13, elegans Caenorhabditis 14 och Homo sapiens 15. Dessa studier har gett viktiga insikter i hur proteiner är organiserade i cellen och därmed viktig information om proteiner med tidigare okända funktioner.
Flera strategier har utvecklats under åren för att studera koder. Dessa tekniker kan grovt delas in i tre kategorier beroende på vilken typ av information de lämnar på protonpumpshämmare (ses över 16-18). Den första är baserad på jäst två-hybrid och dess derivat 19. Dessa tekniker ger information om det direkta sambandet mellan par av proteiner, vilket gör det möjligt att konstruera binära nätverk. Den andra familjen är baserad på affinitetsrening av betesproteiner och identifieringen av deras associerade partners, såsom affinitetsrening följt av masspektrometri 20. Dessa tillvägagångssätt identifiera grupper av proteiner som är direkteller indirekt associerad, i allmänhet på ett stabilt sätt, och är extremt kraftfulla för att identifiera proteinkomplex. Den tredje metoden är baserad på proteinfragment komplemente analyser (SoL) 11,21. Denna metod ger en medelnivå i upplösning mellan de två tidigare metoder, eftersom den tillåter att upptäcka direkta och proximala samband mellan proteiner. Varje teknik har sina egna styrkor och svagheter, som nyligen recenserade 18.
Bäst beskrivna eukaryota PIN är den i särklass en av den spirande jäst Saccharomyces cerevisiae, delvis eftersom dess proteomet är relativt mindre komplex än de andra modell eukaryoter och eftersom hög genomströmning analyser för att detektera PPI har först analyserats och är mer effektivt förs i denna modell organism 9-12. En särskilt kraftfull metod för jästsystemet är dihydrofolatreduktas proteinfragmentkompletteringsanalys (DHFR-PCA), en analys som har varitanvänds i olika sammanhang för att studera jästen PIN i standard och oroad villkor 11,22-26. Denna metod förlitar sig på en överlevnadsanalys som möjliggör detektion av direkta och nästan direkt PPI för ett givet bete protein vid båda endogena uttrycksnivåer och infödda subcellulära lokaliseringar av interaktionspartner 11,21 i ett kvantitativt sätt 27. Den signal som erhålls med hjälp av denna analys (dvs. kolonistorlek på hög densitet koloni arrayer) återspeglar således mängden proteinkomplex som bildas mellan betet och bytesdjur i en cellulär miljö nästan ekvivalent med en av vildtypceller. Analysen är baserad på beredning av en reporter enzymet involverat i folatmetabolism, dihydrofolatreduktas (DHFR), varvid två komplementära fragment av DHFR som är fusionerade till de två proteiner av intresse bringas i närhet när de två proteinerna interagerar, vilket i sin tur leder till reversibel beredning av enzymaktiviteten 11 och tillväxt av stammen på ett medium innehållande metotrexat (MTX; Figur 1). Denna förening inhiberar endogent DHFR-enzym, men inte den muterade en som används i analysen 28. Två samlingar av PCA-stammar, en som innehåller ~ 4300 MATa stammar med en ORF smält till DHFR F [1,2] fragment och en som innehåller ~ 4800 MAT α stammar med en ORF smält till DHFR [3] fragment, kan köpas till implementera DHFR-PCA på liten eller stor skala på alla laboratorier. Här beskriver vi en allmän men detaljerat protokoll till skärmen för PPI mellan en bete protein och ~ 4800 bytes proteiner med hjälp av denna analys.
Vi beskriver ett protokoll baserat på DHFR-PCA-analysen möjliggör systematisk identifiering av fysiska interactmedlemmar för varje given bete protein vid hög genomströmning. Detta protokoll kan anpassas genom att screena efter fler beten, och detta vid varje önskad nivå av replikation. Vi visar tillförlitligheten detta protokoll genom identifiering av fysiska interaktionspartner för ett bete protein involverat i Kärnpor Complex: Nup82. Vår analys aktiverat för att hitta fem tidigare rapporterade Interactmedlemmar och en tidigare orapporterade Interactor (figurerna 3F & 3G), belyser förmågan av metoden för att studera jästproteinet interactome.
Protokollet som beskrivs här innehåller flera kritiska steg som försöksledaren bör uppmärksamma. Vi rekommenderar att 1) Se till att betet DHFR F [1,2] fusion är korrekt (Figur 1B); detta kan uppnås genom sekvensering av konstruktionen och measuring korrekt proteinuttryck med användning av en anti-DHFR F [1,2] eller anti-DHFR-F [3] antikropp; 2) Före början skärmen, rekommenderas att kontrollera om någon bete av intresse uppvisar promiskuösa interaktioner i PCA-skärmar. Detta kan göras genom att utföra kontrollskärmar med beten korsade med den lämpliga L-DHFR kontroll eller genom att manuellt hoppass betet med den lämpliga L-DHFR kontroll och utförande av en tillväxtanalys i MTX-medium. 3) Plattorna bör hällas dagen innan de används, så att fukt är optimalt för cellvidhäftning på agarytan under tryckprocessen; 4) Källa plattor bör inte användas mer än fyra gånger för att överföra tillräckligt med celler på destinationsskylten. Att öka antalet kopior av destinationsplattan kan göras genom successiva steg i expansionen (t.ex. fyra exemplar -> 16 kopior -> 64 kopior). Alternativt kan celler plockas vid olika positioner på gräsmattor eller i kolonin mellan olika rundor av replikering; 5) Om flera positions saknas efter den diploida val (s), se till att käll plattorna inte användes för många gånger i parningssteget (steg 4,5-4,7); 6) Se till att MTX mediet innehåller alla viktiga ingredienser vid rätt koncentrationer. Faktum är att om ingen tillväxt alls observeras på MTX-medium, kan det vara antingen för att ingen interaktion är detekterbar med PCA för proteiner av intresse eller på grund av MTX-medium var inte beredd på rätt sätt. För att säkerställa att mediet tillåter tillväxten av stammar som visar DHFR-fragment komplemente, kan en konstitutiv interaktion sättas vid tomma positioner i samlingen och användes som en positiv kontroll, såsom DHFR-fragment fuserade till leucinblixtlås delar 33 (figur 1C). Parallella tester med de länk-DHFR fragment eller blixtlås-linker-DHFR fragment kommer att tillåta att skilja mellan villkor som gör att alla celler att växa (lågt MTX koncentration eller bete protein som tenderar att göra falska positiva interaktioner, som described nedan) och villkor som förhindrar tillväxten av alla stammar (MTX koncentration för hög eller viktig ingrediens saknas i mediet); 7) Med tanke på att PCA sker genom successiva replika från ett medium till ett annat, kan korskontaminering mellan stammarna mellan olika plattor inträffa om, till exempel, är stiftet-verktyget inte steriliseras ordentligt mellan replikerings rundor och / eller det sista vattnet bath (dvs våt station) i steriliseringsförfarandet är förorenad av kolonier av tidigare replikering rundor. Flera positioner på de arrayer är tomma och kan således användas som kontroll positioner där ingen tillväxt bör följas för att upptäcka korskontamination.
Bildanalys kan utföras med flera publicerade mjukvaror (se avsnitt 5 i protokollet) eller alla anpassade skript. I denna studie, exekverar den anpassade skriptet följande steg: 1) Skriptet drar ifrån pixelvärdena för en tom tallrik att pixelvärdena för varje platta för att samverkarrect för belysning fördomar. 2) Skriptet omvandlar varje bakgrundskorrigerad bild till binära använder ett pixelvärde tröskel på 10. 3) För varje 1536 positionerna för varje platta, bestäms genom att lägga en rektangel på kant kolonierna, körs skriptet ImageJ "Analysera partiklar … "-funktion i en cirkulär markering. Den cirkulära, ställs in med en radie som är lika med intervallet mellan två positioner minus 10 pixlar. 4) Skriptet väljer närmaste partikeln från mitten av markeringen och bekräftar det som en koloni om dess plats är inte mer än halva intervallet mellan två kolonier bort från mitten av markeringen. 5) Skriptet mäter pixelvärden för den valda partikeln på bakgrunden-korrigerade bilden. 6) För att ytterligare korrigera eventuella kvar bakgrundsbelysning fördomar, skriptet subtraherar medelvärdet för alla pixlar från den cirkulära val som inte var en del av en partikel till pixelvärdena i kolonin. Summan av dessa korrigerade pixelvärdear, som är lagrade i kolumnen "IntDenBackSub" av Kompletterande tabell 1, används som ett mått på kolonistorlek.
Ett kritiskt steg inom analysdelen är valet av tröskel betydelse. Här valde vi ett tröskelvärde baserat på fördelningen av den negativa L-DHFR F [3] kontroller, men beroende på målet på skärmen, kan ett sådant tröskelvärde vara för stränga. Faktum L-DHFR F [3] kontroller överuttryckt (stark TEF promotor) så att de komplementära fragmenten spontant kan komplettera varandra och dessa är således inte representativa för uttrycket av de flesta proteiner. Detta understryks av det faktum att fördelningen av L-DHFR F [3] kontrollerna är högre än genomsnittet i bakgrunden tillväxt (figur 3D). Således kan interaktioner med poäng under denna stränga tröskel men det är helt klart utanför bakgrundstillväxten fördelningen kan betraktas som förmodade hits som kan representera, till exempel, övergående eller svag interåtgärder. Dessa kan studeras närmare och kors valideras om, till exempel, är de två proteinerna uttrycks inte på nivåer som kan tillåta den spontana komplettering av DHFR fragmenten som de L-DHFR kontroller. Som ett alternativ, kan man ställa in en signifikans tröskelvärde baserat på andelen överlappning med rapporterade fysiska interactmedlemmar i databaser som BioGRID 35 för att maximera andelen sant positiva över falska positiva. Men till skillnad från användningen av L-DHFR distribution, detta alternativ kan inte alltid vara möjlig om, till exempel, är antalet kända fysiska Interactmedlemmar inte tillräckligt hög. Dessutom valet av tröskeln betydelse påverkar andelen falska positiva och falska negativa i den slutliga datamängden. Faktiskt, liksom alla andra analys PPI upptäckt, kan falska positiva resultat av ospecifik interaktion av ett protein med DHFR-fusionsprotein om, till exempel, är det protein mycket riklig som tidigare nämnts. Dettaexemplifieras av det faktum att vissa bytesdjur systematiskt interagera med alla betes proteiner i PCA skärmar och därmed måste tas bort från analysen 11 (t.ex. Tef2 och Ade17 och kompletterande tabell 2). För att kringgå detta problem, en kontroll PCA skärm av de två samlingarna mot lämplig L-DHFR styrning (F [1,2] eller F [3]) för att identifiera beten och bytesdjur som uppvisar spontan DHFR fragment komplettering kan utföras i de särskilda villkoren på varje skärm. Dessutom kan utföra en Gene Ontology anrikning analys öka förtroendet i data om funktionen av en viss bete är känd. Å andra sidan, kan DHFR-PCA ger upphov till falska negativa resultat av flera skäl: 1) inte alla proteiner kan fuseras till DHFR-fragment, eftersom dessa kan destabilisera proteinerna eller modifiera deras lokalisering om, till exempel, den DHFR-fusion till C-terminalen interfererar med en lokaliseringssignal; 2) DHFR rekonstitution i vissa cellulära avdelningar may inte producerar folat om, till exempel, är inte tillgänglig en nödvändig förutsättning för folat syntes; 3) C-terminaler behov att vara inom ett avstånd av 8 nm för DHFR komplemente inträffa 11. Således kan en välkänd interaktion inte upptäckas om deras C-terminaler inte tillräckligt nära i rymden. Detta exemplifieras här av det faktum att en stor del av Nup82 fysiska interaktioner rapporterats i databaser, varav de flesta är indirekt, inte registreras i vårt test. På samma sätt kommer interaktioner mellan membranproteiner som C-terminalerna är i trans i förhållande till membranet inte leda till DHFR fragment komplettering och kommer inte att upptäckas 11. Begränsningar 1) och 3) kan kringgås relativt enkelt genom att smälta DHFR-fragmentet till N-terminalen av proteinet. Detta kan förhindra att störa en lokaliseringssignal nära C-terminaler och kan tillåta att upptäcka en interaktion mellan membranproteiner vars N och C-terminalen är i cis släktingtill membranet.
Flera utmaningar återstår i studien av PIN-koder (över i 2,3). De kartor över PIN hittills producerats har till stor del beskrivs i ett enda försöks förutsättning för varje art och därmed erbjuda en enda ögonblicksbild av hur proteinnätverk kan organiseras. Det finns därför ett behov av att utforska andra experimentella betingelser för att se hur PIN-koder kan omorganiseras som svar på miljöförändringar, specifika stimuli, över utveckling eller följande mutationer. Dessa utmaningar kommer att övervinnas genom utveckling av ny teknik för förhör PPI i realtid, i levande celler och genom att anpassa nuvarande tekniker så att de kan användas av en större gemenskap av laboratorier. Som en kvantitativ teknik som kan upptäcka förändringar i mängden DHFR komplemente komplex 27, kan DHFR-PCA anpassas för att övervinna dessa utmaningar och har använts för att studera hur PPI påverkas av ett DNA-skadande medel 22 </sup>, kemiska medel 25, gen strykningar 23,26 eller i andra jästarter och hybrider 33. Exploring dessa nya dimensioner kommer att bli allt viktigare för att avslöja den dynamiska av PIN.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Canadian Institute of Health Research (CIHR) Grants 191.597, 299.432 och 324.265, en naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada Discovery bidrag och en Human Frontier Science Program bidrag till CRL. CRL är en CIHR New utredare. Guillaume Diss stöds av en Proteo gemenskap. Samuel Rochette stöds av NSERC och FRQNT gemenskaper.
Name of Material/Equipement | Company | Catalog Number | Comments/Description |
BioMatrix Robot, Bench-top Configuration | S&P Robotics Inc. | BM5-BC | |
96-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-96-10 | Standard 96-format Pin-tool with 96 high-precision floating pins |
384-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-384-10 | Standard 384-format Pin-tool with 384 high-precision floating pins |
1536-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-1536-05 | Custom 1536-format Pin-tool with 0.5mm high-precision floating pins |
Automated imaging module | S&P Robotics Inc. | IMG-02 | |
Methotrexate | Bioshop Canada Inc. | MTX440 | CAUTION: toxic compound |
Hygromycin B | Bioshop Canada Inc. | HYG003 | |
Nourseothricin dihydrogen sulfate | Werner BioAgents | 5010000 | |
Yeast-Interactome Collection | Thermo Scientific | YSC5849 | |
Omni Tray w/lid sterile | Thermo Scientific | 242811 | |
Anti-DHFR F[1,2] antibody | Sigma-Aldrich | D1067 | |
Anti-DHFR F[3] antibody | Sigma-Aldrich | D0942 |