Intubation vermittelte intratracheale (IMIT) Instillation von Reagenzien ist ein ausgezeichnetes, nicht-invasive Methode zur Untersuchung Atemwegserkrankungen, sowie ein Verfahren zum Einträufeln therapeutische Reagenzien direkt in die Lunge. Es ist eine schnelle und hoch reproduzierbare Methode, die sich für vorklinische Tests ist.
Atemwegserkrankungen Studien beinhalten typischerweise die Verwendung von murinen Modellen als Ersatzsysteme. Es gibt jedoch signifikante physiologische Unterschiede zwischen dem murinen und menschlichen Atemwege, insbesondere in ihren oberen Atemwege (URT). In einigen Modellen können diese Unterschiede in der murinen Nasenhöhle einen signifikanten Einfluss auf den Krankheitsverlauf und die Darstellung in der unteren Atemwege (LRT) haben bei Verwendung intranasale Instillation Techniken, die Nützlichkeit der Mausmodell limitierender um diese Krankheiten zu untersuchen. Aus diesen Gründen wäre es vorteilhaft, ein Verfahren, um Bakterien direkt in den Mäuselungen um LRT Erkrankung in Abwesenheit der Beteiligung des URT studieren vermitteln zu entwickeln. Wir haben diesen Lungen bestimmte Liefer Technik Intubation vermittelte intratracheale (IMIT) Instillation bezeichnet. Dieses nichtinvasive Technik minimiert das Potential zur Instillation in die Blutbahn, die während invasiver Servier auftreten kannonal chirurgischen intratrachealer Infektion Ansätze, und begrenzt die Möglichkeit der zufälligen Verdauungstrakt Lieferung. IMIT ist ein zweistufiges Verfahren, bei dem Mäuse werden zunächst intubiert, mit einem Zwischenschritt, um die korrekte Platzierung des Katheters in der Luftröhre zu gewährleisten, gefolgt von Einführen einer stumpfen Nadel in den Katheter zur direkten Abgabe von Bakterien in den Lungen zu vermitteln. Dieser Ansatz ermöglicht eine> 98% Wirksamkeit der Zustellung in die Lunge mit hervorragenden Verteilung der Reagenzien in der gesamten Lunge. Somit stellt IMIT einen neuartigen Ansatz zur LRT Krankheit und therapeutische Abgabe direkt in die Lunge zu untersuchen, die Verbesserung bei der Fähigkeit, Mäuse als Surrogate für die menschliche Atemwegserkrankung zu untersuchen verwenden. Darüber hinaus macht die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit dieses Abgabesystem es auch zugänglich Good Laboratory Practice Standards (GLPS), sowie die Lieferung von einer Vielzahl von Reagenzien, die hohe Effizienz in der Lunge erforderlich.
Mäusen wurden verwendet, um zahlreiche menschliche Krankheitserscheinungen, einschließlich einer Vielzahl von Erkrankungen der Atemwege zu modellieren. Surrogatkrankheitsmodelle sind häufig nicht in der Lage, alle Aspekte eines modellierten Erkrankung rekapitulieren, typischerweise aufgrund von wichtigen physiologischen oder Immun Unterschiede in den beiden Aufnahmemodelle. Somit ist ein Ziel der Verbesserung der Modellsysteme, um Ansätze, die Surrogate, enger spiegeln einen Krankheitsprozess oder Gastgeber Antwort als in der ursprünglichen Host-System beobachtet ermöglichen zu entwickeln. Es gibt mehrere wichtige physiologische Unterschiede zwischen Mäusen und Menschen in der Mechanismus, durch den sie Luft zu begeistern. In diesen Unterschieden gehören bedeutende ratiometrische Größenunterschiede zwischen den URT und LRT. Es wurde geschätzt, dass Mäuse besitzen> 100 die URT Fläche bezogen auf den Menschen, normalisiert gegen totale Lungenkapazität 1,2 falten. Somit werden die Nasenmuscheln der Maus ermöglichen eine umfangreiche Filterung von eingeatmeten Luft, um eine viel größere Geschwindigkeit von breathi erleichternng, die einen erheblichen Einfluss auf Untersuchungen der Lungenentzündung aufweisen kann, wenn eine Infektion der Nasenhöhle spielt eine bedeutende Rolle bei der Progression der Erkrankung.
Es wurden verschiedene Ansätze verwendet, um Bakterien in den Lungen von Mäusen vermitteln, um menschenähnliche Atemwegserkrankungen zu untersuchen. Die häufigste dieser Ansätze ist die intranasale Impfung, bei dem eine flüssige Suspension wird auf einer oder beiden Nasenlöchern einer Maus aufgetragen. Während relativ einfach, Vorbehalte wie Einträufeln Volumen und Art der Anästhesie verwendet wird, kann die Effizienz der Instillation über intranasale Impfung 3-5 in die LRT auswirken. Insbesondere Miller et al. haben gezeigt, dass die intranasale Applikation von Francisella tularensis in Mengen von weniger als 50 & mgr; l nicht in dem Einträufeln der Bakterien führen in die LRT 6 gezeigt. Sie weiterhin beobachtet besser LRT Instillation bei Verwendung inhalativen Isofluran im Gegensatz zu injiziert Ketamin / Xylazin für Anästhesie. Aber unsere experience mit Yersinia pestis intranasale Impfung zeigt konsequenter Impfung kann mit Ketamin / Xylazin erreicht im Vergleich zu Isofluran (MBL, unveröffentlichte Daten) werden. Diese Unterschiede könnten zurückzuführen verwendet Erreger oder bei Laborverfahren Vielfalt, aber wichtiger ist unterstreichen das Potenzial Variabilität in dieser Technik. Weiterhin Lungen kurz nach intranasaler Instillation zeigen, daß ein relativ geringer Prozentsatz der ursprünglichen bakteriellen Inokulums die Lunge erreicht geerntet (in dem Fall von Y. pestis, wurden nur 10% zurückgewonnen 1 h nach der Instillation 7), was darauf hindeutet, dass eine große Anzahl von Bakterien konnte in der URT beibehalten werden (oder in den GI-Trakt Verschlucken). In bestimmten Krankheitsmodellen kann dies signifikante Ablagerung von Bakterien auf der Schleimhaut URT unser Verständnis des Fortschreitens der Krankheit zu verwechseln, wenn der Organismus in der Lage, die Kolonisierung der murine Nasenhöhle in einer Weise, die dem menschlichen Krankheit ist. Zum Beispiel unter Verwendung von in vivo </ Em> Bildgebung, wurde beobachtet, dass Burkholderia pseudomallei, die den menschlichen URT nicht besiedeln wird, bewirkt eine überwiegende opportunistische Infektion der Nasenhöhle, wenn murine die intranasale Instillation Methode 8 geliefert.
Andere Verfahren zum Einträufeln Bakterien in den Lungen der Mäuse wurden auch in Infektionsforschung eingesetzt. Im Vergleich zu intranasale Instillation diese Methoden neigen jedoch dazu, mehr technisches Know-how und / oder teure Ausrüstung, ohne die Beseitigung der Potenzial für Infektion Einleitung an mehreren Standorten (zB Aerosol [URT und LRT] erfordern; transorale [Verdauungstrakt und LRT]; und chirurgische intratracheale [LRT und Blutstrom]). Angesichts der möglichen Komplikationen, die mit sekundären Standorten der Infektion in Verbindung gebracht werden konnte, haben wir versucht, eine intratracheale Ansatz, der die URT umgeht und liefert Erreger direkt in die Lunge von betäubten Mäusen zu entwickeln, sondern begrenzt auch unbeabsichtigte inoculatIon in den Blutstrom oder GI-Trakt. Zu diesem Zweck wurde Intubation vermittelte intratracheal (IMIT) Instillation als nicht-chirurgischen Verfahren, LRT Instillation Inokulum gewährleistet, indem ein Zwischenschritt zur richtigen Platzierung des Katheters vor dem Einträufeln überprüfen entwickelt. Dieses Verfahren wird unter Verwendung von Farbstoff-Instillation beschrieben visuell nachweisen breite Verteilung des Inokulums in der gesamten Lunge und P. aeruginosa Einträufeln in das hochwirksame Lieferung (> 98% des Inokulums) dieses Verfahrens in die Lunge nachzuweisen. Wichtig ist, während ursprünglich für bakterielle Liefer entwickelt, bietet IMIT auch ein wirksames Instrument für: i) Instillation verschiedener Moleküle für die Untersuchung von anderen Krankheitsmodellen Atem, ii) lungenspezifischen therapeutischen Lieferung und iii) Grundlungenfunktion Studien, einschließlich gezielter siRNA in die Lunge.
IMIT Einträufeln bietet wichtige Verbesserungen an bestehenden Modellen Atemwegserkrankungen in der Fähigkeit, reproduzierbar einzuflößen Reagenzien direkt in die Lunge. Es ist eine schnelle Annäherung, die ideal für ein Team von zwei Forschern, von denen man es schafft die Logistik der Anästhesie und Käfighaltung liegt, und die andere, die das IMIT Technik führt. 3 min pro Maus – Große Studien können unter Verwendung IMIT mit einem durchschnittlichen Zeitaufwand von 2 durchgeführt werden. Da der Ansatz nutzt Isofluran als Anästhetikum, Mäuse erholen sich rasch aus der Narkose, die Verringerung der Haltungszeit der Überwachung Tiere durch Erholung.
Die technisch schwierigste Aspekt der IMIT Verfahren ist der erste Schritt der Intubation Mäusen. Menschen lernen IMIT auszuführen in der Lage sind, auf diesem ersten Schritt der Platzierung des Katheters und die Gewährleistung, dass die Intubation wurde durch die visuelle Bestätigung der Farbstoffbewegung erreicht konzentrieren. Der Vorteil des Ansatzes ist, dass Lungen-specific Einträufeln wird durch die Verwendung der Bestätigung der Intubation, die das Vertrauen sowohl der neue Forscher sowie der Experte versucht den schwierigen Tier intubieren erhöht garantiert. Die wichtigsten Elemente der Optimierung der Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Intubation sind: i) Erreichung einer tiefen Sedierung, genügend Arbeitszeit zu ermöglichen, ii) die korrekte Platzierung des Trichtern in den Mund, um eine gute Visualisierung des Kehldeckels ermöglichen, iii) gute Tiefe Platzierung der Trichter, so daß die Zunge bleibt während des Verfahrens zurückgezogen wird, und iv) die Verwendung der Kipp-Plattform, um die Hände des Forschers zu unterstützen, so dass das Verfahren entspannt und mit einem stetigen Ansatz durchgeführt.
Eine der Einschränkungen des IMIT Verfahren wird auf die Frequenz des IMIT Instillation Ereignissen. Aufgrund der möglichen Trauma mit einer verpassten Intubation verbunden sind, ist es nicht empfehlenswert, dass mehr als zwei Intubationsbemühungen (bis zu zwei Fehlschüsse) in einer einzigen Sitzung durchgeführt werden. IMIThat ein ausgezeichnetes Potenzial in seiner Fähigkeit verwendet werden, um Therapeutika in das murine Lungen liefern kann jedoch Therapieschemata, die Verwendung von sehr häufige Abgabe von Reagenz in die Lunge zu nicht geeignet für IMIT sein. Es ist möglich, dass IMIT konnte täglich verwendet, um Reagenzien in eine murine Lungen ohne bedeutende Trauma zu liefern, aber nur, wenn sie durch einen hochqualifizierten Forscher durchgeführt, da die Mehrheit der Trauma Intubation assoziiert ist gedacht, um mit einem verpassten Intubation Ereignis zugeordnet werden . Solche Hochfrequenz IMIT sollte mit lokalen Tierärzten und IACUC diskutiert werden.
Eine zusätzliche Einschränkung des potentiellen IMIT ist die Größe der Maus, wobei intubiert wird. 22 g, bei einer 20-g-Katheter wurde gefunden, daß eine geeignete Größe für die Luftröhre von Mäusen in diesem Größenbereich sind – das oben beschriebene Verfahren wurde unter Verwendung IMIT Mäusen von etwa 17 entwickelt. Größere Kathetern wurden erfolgreich in älteren Mäusen verwendet; die anfängliche Entwicklung von IMIT made Verwendung einer 18 G-Katheter in BALB / c-Mäusen, die> 20 g sind. Wichtig ist, dass, wenn alternative Kathetergrößen verwendet werden, sollten stumpfen Nadeln stammen, welche das Lumen des Katheters zu passen und mit einer Länge, die gerade über die Katheterspitze 1 mm erstreckt getrimmt werden. Intubation von Mäusen kleiner als 17 g ist möglich, wird aber nicht durch die erforderliche Fachwissen empfohlen und würde die Verwendung von kleineren Kathetern und Spekula als oben beschrieben erforderlich.
Wir haben IMIT für die Lieferung von mehreren Atemwegspathogene neben P. verwendet aeruginosa, einschließlich B. pseudomallei 9 und Klebsiella pneumoniae 10. Die IMIT Modell hat wichtige Fortschritte in unseren Studien von B. gemacht pseudomallei Atemwegserkrankungen, nachdem festgestellt, dass die intranasale Impfung bewirkt eine frühe, URT-Morbidität von Mäusen statt der systemischen Erkrankung Endpunkt in menschlichen Erkrankungen 9 beobachtet. B. pseudomallei ist ein Tier 1 Select Agent der Abwehr von Biowaffen Auswirkungen, und als solche, Modelle Atemwegserkrankungen werden für Aerosolexposition entwickelt, welche Modelle ein potenzieller Biodefense bezogenen Route der Eintrag für waffenKrankheitsErreger. Da aktuelle Aerosolmodelle führen zu Infektion sowohl der URT und LRT, das gleiche Potential früh Morbidität Phänotypen haben wir für die intranasale Modell von B. identifiziert pseudomallei Atemwegserkrankung kann dem Aerosol Modell anzuwenden. Eine zukünftige Anpassung der IMIT Modells könnte eine Intubation vermittelte Aerosolabgabe (IMAD), in dem Mäuse werden für die Zielaerosolabgabe nur in die Lunge intubiert werden. Mechanische Ventilatoren derzeit zur Verfügung stehen Isofluran-Narkose, die angepasst werden kann, um eine aerosolierten, anstatt auf Flüssigkeitsbasis, Erreger Herausforderung liefern zu halten.
IMIT wurde zunächst als ein Ansatz entwickelt, um die Abgabe von Bakterien in der Lunge zu optimieren, sondern findet auch Anwendung für die Lieferung von anderen Reagenzien in der Mäuselunge. Als disoben diskutiert, intranasale Verabreichung von Verbindungen in Mäuse führt zu einer geringen Effizienz, sehr variable Lieferung von Reagenzien in das Zielorgan Lunge. Intranasale Verabreichung von Positronen-Emissions-Tomographie (PET) Bildgebung Reagenzien zu der Mäuselunge ergab eine 40% Liefereffizienz 11, während wir haben gezeigt, dass IMIT bietet eine hervorragende Alternative zu anderen Lungenliefer nähert mit> 98% Liefer Wirksamkeit und multilobäre Verteilung. Diese Verbesserung in der zielgerichteten Abgabe an die Lunge hat das Potential, die Reproduzierbarkeit der therapeutischen Abgabe zur Behandlung von Lungenerkrankungen. IMIT könnte ähnlich Vorteile anbieten, um Studien über: i) die Auswirkungen von Umweltlungenreizstoffe, ii) Lungenkrebs phänotypische Studien, iii) lungenspezifischen siRNA knock-down.
The authors have nothing to disclose.
The authors are grateful for the support from the Center for Predicative Medicine Animal Models (Carol Vanover, Ashley Biller and Jennifer Kraenzle) and Microbiology (Daniel Cramer and Julie Sotsky) Core Facilities. This work was supported by funding from the NIH (HHSN272201000033I to M.B.L and J.M.W.).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Rodent, Tilting WorkStand | Hallowell EMC | 000A3467 | Base should be detached when working in a BSC |
Operating Otoscope Head | Welch Allyn | 21700 | |
Otoscope 3.5 V Li Battery | Welch Allyn | 71900 | |
Mouse Intubation Specula short, Autoclaveable | Hallowell EMC | 200A3589S | |
Incisor Loops | Hallowell EMC | 210A3490A | |
Cotton fine tip applicator | Puritan | 871-PC DBL | Used for tongue retraction |
I.V. Catheter, 20G | Exel Int | 26741 | Optional: fit a silicon sleeve with 10mm exposed catheter surface |
Gas tight syringe, 250ul | Hamilton | 81120 | Used for delivery of liquid inoculum by IMIT |
Blunt Needle, 22G | Hamilton | 91022 | Trim to length to protrude 1mm from 20G catheter |
Guide wire (Fiber optic wire, 0.5mm) | TheFiberOpticStore.com | FOF .50 | Cut to 6" length: used as guide wire for intubation |
Tuberculin syringe, 1ml | Becton Dickinson | 309659 | Assemble with fiber optic wire as guide wire |
Brilliant Blue R (Coomassie) | Sigma | B0149 | |
Tygon tubing, 1/16" | Saint Gobain | ALC00002 | |
Male luer 1/16" barb | Cole Parmer | 45503-22 | |
Female luer 1/16" barb | Cole Parmer | 45500-00 | |
Lidocaine, USP | Spectrum | LI102 | pH lidocaine into solution at 2%(w/v) pH7.0 |
Sample bag, 1oz | Whirl-Pak | B01067 | |
U-bottom 96 well plate, sterile | Greiner | 650161 |