Обнаружение Истинного IgE-выражения мышь B Lineage клеток
Summary
In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.
Abstract
B-лимфоцит тяжелой цепи иммуноглобулина (IgH) коммутатор класса рекомбинации (КСО) является процесс, в котором изначально выразил IgM переключается на другие IgH изотипами, таких как IgA, IgE и IgG. Измерение IgH КСО в пробирке является основным методом для изучения ряда биологических процессов, начиная от рекомбинации ДНК и ремонт, чтобы аспектах молекулярной и клеточной иммунологии. В пробирке КСО анализ включает измерительной поверхности Ig выражение проточной цитометрии на активированных В-клеток. В то время как измерение IgA и IgG подклассов проста, измерение IgE с помощью этого метода является проблематичным в связи с растворимыми IgE связывания с FcεRII / CD23 экспрессируется на поверхности активированных В-клеток. Здесь мы опишем уникальная процедура для точного измерения IgE-продуцирующих мыши В-клетки, которые прошли КСО в культуре. Метод основан на трипсина-опосредованного расщеплени IgE-CD23 комплексов на поверхности клеток, что обеспечивает обнаружение IgE-продуцирующих В клональные клеток путем CYtoplasmic окрашивание. Эта процедура предлагает удобное решение для проточной цитометрии анализа КСО IgE.
Introduction
Во время тяжелой цепи иммуноглобулина (IgH) коммутатор класса рекомбинации (КСО) у мышей и людей, IgH μ постоянные экзоны область (cz М) удаляются и заменяются одним из нескольких наборов вниз по течению постоянных экзонов области (C H) (например Cγ, с £ и Са), в результате чего переход от производства IgM к производству других классов Ig (например, IgG, IgE, IgA или). КСО происходит в течение переключатель (S) регионов, которые 1-10 кб последовательности, расположенные 5 'к каждому набору C H S 1. Вызванные активацией цитидиндеаминаза (AID) фермент инициирует КСО с помощью цитидиновое дезаминирования деятельности.
IgE является ключевым медиатором аллергических заболеваний 2 и более глубокое понимание того, как IgE производится и регулируется может открыть двери для новых терапевтических подходов к атопическим заболеванием. У мышей и человека, IgE является наиболее жестко регулируется Ig изотипа. IgE, как правило, обнаруживается на уровнях тысяч ТимаES меньше, чем другие изотипы IgH 3, но может быть значительно выше у болезненных состояний 4. Тем не менее, КСО IgE не полностью поняты. В пробирке активации В-клеток с помощью IL-4 в комбинации с любой анти-CD40 или LPS индуцирует КСО как IgG1 и IgE 5. Активированные В-клетки выразить низким сродством IgE рецептор FcεRII / CD23 2,6, который связывает растворимый IgE, секретируемый в культуре после КСО. Поэтому при анализе с проточной цитометрии, В-клетки с рецептором IgE связаны пятна аналогично B клетки, эндогенно экспрессирующих IgE 7. Хотя известно, что мыши B-клетки экспрессируют низкое сродство рецептора IgG FcγRIIB1 (CD32) 8, в нашем опыте это не по всей видимости, мешает измерению класса переключение на IgG1. Тем не менее, при измерении переключение IgE после активации В-клеток в культуре, неспецифический поверхностно-св занный IgE может скрывать анализ. С общими методами окрашивания, не-IgE-экспрессирующие клетки окрашиваются положительно для IgE.
Изложенные здесь стратегия, которая была использована для проведения КСО анализов и выявления истинных IgE-выражения В-клеток у мышей, 9 – 11. Лечение активированных В-клеток с трипсином, общий лаборатории реагент, чтобы переварить белок, устраняет как cytophylic и мембраной поверхность IgE. После пермеабилизации и окрашивание цитоплазмы IgE, таким образом, показывает истинное IgE-продуцирующих клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Стимуляция мыши селезенки В-клеток в культуре с анти-CD40 и IL-4 будет имитировать Т-хелперов 2-го типа (T H 2) взаимодействие, поощрение переключение класса для IgG1 и IgE 5. В-клетки могут быть активированы для КСО в контексте общего спленоцитов 12 или в очищенных В-клеток селезен…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DRW поддерживается за счет грантов НИЗ AI089972 и AI113217, а также слизистой оболочки иммунологии исследований группы, и имеет награду карьеры для ученых-медиков из Wellcome Фонда Burroughs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Mouse IgE FITC | BD Pharmingen | 553415 | clone R35-72 |
| Rat Anti-Mouse IgG1 PE | BD Pharmingen | 550083 | clone A85-1 |
| Methanol | BDH | BDH1135-4LP | Keep at -20 °C |
| Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon | Corning | 352340 | |
| Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon | Corning | 352350 | |
| Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-4052-82 | clone RA3-6B2 |
| anti-Mouse/Rat CD40 | eBioscience | 16-0402-85 | clone HM40-3 |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| MEM-NEAA (100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Phosphate Buffered Saline (10X) | Lifetechnologies (Corning) | 46-013-CM | |
| MACS CD45R (B220) microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-501 | |
| MACS purification column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| IL-4 | PeproTech | 214-14 | Reconstitute in water or 0.1% BSA |
| Formalin Solution, Neutral Buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Trypsin-EDTA Solution (10X) | Sigma Aldrich | T4174-100mL | 5.0g Trypsin, 2.0g EDTAŸ4Na per Liter of 0.9% NaCl |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100mL | 10,000U Penicillin; 10 mg/mL Streptomycin (100X) |
| L-Glutamine 200mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
| 2-mercaptoethanol (99%) | Sigma Aldrich | M6250-100mL | |
| Red cell lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| Rat Anti-Mouse IgM RPE/cy7 | SouthernBiotech | 1140-17 | clone 1B4B1 |
| HyClone Fetal Calf Serum | Thermo | SH30910.03 | |
| B cell Stimulation media | B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1X MEM-NEAA, 2.0mM L-glutamine, 1X Penicillin-Streptomycin (Penicillin:100 U/ml, Streptomycin: 100 µg/ml), Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/mL), and anti-CD40 (1 µg/mL) |
References
- Chaudhuri, J., et al. Evolution of the immunoglobulin heavy chain class switch recombination mechanism. Advances in immunology. 94, 157-214 (2007).
- Gould, H. J., Sutton, B. J. IgE in allergy and asthma today. Nature reviews. Immunology. 8, 205-217 (2008).
- Winter, W. E., Hardt, N. S., Fuhrman, S. . Immunoglobulin E. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 124 (9), 1382-1385 (2000).
- Ozcan, E., Notarangelo, L. D., Geha, R. S. Primary immune deficiencies with aberrant IgE production. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 122, 1054-1062 (2008).
- Bacharier, L. B., Geha, R. S. Molecular mechanisms of IgE regulation. The Journal of allergy and clinical immunology. 105, 547-558 (2000).
- Yokota, A., et al. Two species of human Fc epsilon receptor II (Fc epsilon RII/CD23): tissue-specific and IL-4-specific regulation of gene expression. Cell. 55 (4), 611-618 (1988).
- Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of experimental medicine. 207, 417-427 (2010).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. Fcgamma receptors as regulators of immune responses. Nature reviews. Immunology. 8 (1), 34-47 (2008).
- Callen, E., et al. 53BP1 mediates productive and mutagenic DNA repair through distinct phosphoprotein interactions. Cell. 153 (6), 153-1280 (2013).
- Wesemann, D. R., et al. Reprogramming IgH isotype-switched B cells to functional-grade induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13745-13750 (2012).
- Wesemann, D., et al. Immature B cells preferentially switch to IgE with increased direct Sµ to Sε recombination. The Journal of experimental medicine. 208 (13), 2733-2746 (2011).
- Zarrin, A. A., et al. An evolutionarily conserved target motif for immunoglobulin class-switch recombination. Nature immunology. 5, 1275-1281 (2004).
- Fan, G., et al. Development of a class-specific polyclonal antibody-based indirect competitive ELISA for detecting fluoroquinolone residues in milk. Journal of Zhejiang University. Science. B. 13 (7), 545-554 (2012).
- Perez, O., Krutzik, P., Nolan, G. Flow cytometric analysis of kinase signaling cascades. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 263, 67-94 (2004).
- Jamur, M., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 588, 55-61 (2010).
- Ishizaka, T., Ishizaka, K. Mechanisms of passive sensitization. IV. Dissociation of IgE molecules from basophil receptors at acid pH. Journal of immunology (Baltimore, MD. : 1950). 112 (3), 1078-1084 (1950).
- Erazo, A., et al. Unique Maturation Program of the IgE Response In Vivo. Immunity. 26, 191-203 (2007).
- Xiong, H., Dolpady, J., Wabl, M., Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. Sequential class switching is required for the generation of high affinity IgE antibodies. Journal of Experimental Medicine. 209, 353-364 (2012).
- Yang, Z., Sullivan, B., Allen, C. Fluorescent in vivo detection reveals that IgE(+) B cells are restrained by an intrinsic cell fate predisposition. Immunity. 36 (5), 857-872 (2012).
- Berkowska, M. A., et al. Human IgE(+) B cells are derived from T cell-dependent and T cell-independent pathways. The Journal of allergy and clinical immunology. , (2014).
- He, J. -. S., et al. The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response. The Journal of experimental medicine. 210 (12), 2755-2771 (2013).
- Keegan, A., Fratazzi, C., Shopes, B., Baird, B., Conrad, D. Characterization of new rat anti-mouse IgE monoclonals and their use along with chimeric IgE to further define the site that interacts with Fc epsilon RII and Fc epsilon RI. Molecular immunology. 28 (10), 1149-1154 (1991).
