마우스의 메인 후각 시스템의 섬모의 전체 마운트 라벨링
Summary
Cilia of olfactory sensory neurons contain proteins of the signal transduction cascade, but a detailed spatial analysis of their distribution is difficult in cryosections. We describe here an optimized approach for whole mount labeling and en face visualization of ciliary proteins.
Abstract
The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single dendrite to the surface of the epithelium, ending in a structure called dendritic knob. Cilia emanate from this knob into the mucus covering the epithelial surface. The proteins of the olfactory signal transduction cascade are mainly localized in the ciliary membrane, being in direct contact with volatile substances in the environment. For a detailed understanding of olfactory signal transduction, one important aspect is the exact morphological analysis of signaling protein distribution. Using light microscopical approaches in conventional cryosections, protein localization in olfactory cilia is difficult to determine due to the density of ciliary structures. To overcome this problem, we optimized an approach for whole mount labeling of cilia, leading to improved visualization of their morphology and the distribution of signaling proteins. We demonstrate the power of this approach by comparing whole mount and conventional cryosection labeling of Kirrel2. This axon-guidance adhesion molecule is known to localize in a subset of sensory neurons and their axons in an activity-dependent manner. Whole mount cilia labeling revealed an additional and novel picture of the localization of this protein.
Introduction
비강의 마우스 후각 상피 6-10000000 바이폴라 후각 감각 신경 (1)을 포함한다. 각각의 후각 신경 세포는 표현 1,200 후각 수용체 유전자 중 하나를 선택합니다. 냄새 물질의 검출은 4 OLF 후각 특정 G 단백질 Gα를 통해 아데 닐 레이트 사이 클라 유형 III (ACIII) 3를 활성화 후각 수용체 2에 결합 부 취제에 의해 시작됩니다. 사이 클릭 아데노신 모노 포스페이트 (cAMP)의 상승의 결과가 열립니다 염기 – 게이트 비 선택적 양이온 채널은 칼슘과 나트륨 +, 이후 칼슘의 유입으로 이어지는, (CNG) 2+ 유입 칼슘 활성화 (CL)의 개방에 이르게주기 – 채널 5, 6. 외부 CL 결과 – 플럭스는 높은 세포 (CL)에 의해 촉진된다 – 나 + / K + / CL을 통해 가능성 흡수, – – 공동 수송 NKCC1, 농도는 정상 (CL)에 의해 유지CL – / HCO3 – 교환 SLC4A1, 그리고 아마도 추가로 아직 확인되는 수송 6-8.
바이폴라 후각 신경 세포는 하나의 분지 후각 망울에 직접 투사 축삭과 상피의 표면에 연장하고 전문 구획, 수지상 노브로 끝나는 수상 돌기가있다. 최대 μm의 50 ~ 60까지의 길이에 도달 할 수 있습니다이 노브, 10 ~ 30 섬모,에서, 상피면 (9)을 덮고있는 점액으로 발산. 표준 신호 전달 캐스케이드의 단백질은 주로 이러한 섬모의 막 지역화됩니다. 상피 세포의 증가 된 감각 표면 취기를 감지하는 능력을 증폭한다. 인해 감각 뉴런의 밀도, 인접 수지상 노브로부터 연장 섬모 섞이는. 상피 세포의 표면 상에, 후각 수용체를 발현하는 다른 유형의 다른 뉴런의 섬모의 임의의 혼합물이 섞여서 결과. 검출 및 세포감각 신경의 일부에만 존재하는 섬모 단백질의 울라 할당은 저온부에서 어렵다. 저온부는 섬모의 평균 길이보다 일반적으로 더 얇은 때문에 또한, 섬모 따라 단백질의 정확한 정위 간신히 가능하다.
후각 신경 세포에서 지금까지 규명하지 않은 막 단백질의 섬모 현지화의 조사를 가능하게하기 위해, 우리는 섬모의 단백질 현지화의 상세한 분석을 허용하는 페이싱 준비 기술을 최적화. 요약하면, 마우스들을 희생하고 헤드는 중앙선 근처에 분할된다. 비갑개, 코, 그리고 정면 뼈 격막을 노출 제거됩니다. 안감 상피의 후각 부분 격벽은 비강에 모든 연결을 절단하여 느슨하게된다. 링거액 가득 페트리 접시에 격막을 넣은 후, 상피 코팅 된 유리 슬라이드로 전송 싶게 벗겨. 짧은 fixat 다음취급 깨지기 조직의 손상을 피하기 위해 가능한 한 완만 한 경우, 이온 단계는, 면역 염색 절차를 행할 수있다. 우리는 고전 저온부 및 설명 페이싱 제제 후각 섬모 두 가지 막 단백질의 염색을 비교하여 해상도를 달성 보여준다.
Protocol
Representative Results
Discussion
The en face preparation technique described in this protocol provides a powerful tool for the detailed analysis of the olfactory system. So far, most studies characterizing the localization of signaling proteins use immunostainings of cryosections. They present a good overview of the olfactory epithelium, and protein expression in distinct cell types or regions can be easily identified. However, expression in olfactory cilia is sometimes hard to detect. Even if ciliary localization is obvious, cryosections offer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (Exc257, SFB958).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Spring scissors | straight tip, multiple suppliers | ||
| Surgical scissors | sharp and blunt end, multiple suppliers | ||
| Fine forceps | curved tips, Dumont #7, multiple suppliers | ||
| Razor blade | extra thin, multiple suppliers | ||
| Binocular with illumination | multiple suppliers, Stemi 2000-C, Zeiss | ||
| Petri dish | multiple suppliers | ||
| Liquid-blocker pen | Science Services | N71310 | |
| Polysine coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| primary antibody Goat anti-Kirrel2 | R&D Systems | AF2930 | 1:200 |
| primary antibody Rabbit anti-mOR-EG | Baumgart et al., 2014 | 1:200 | |
| secondary antibodies | Life Technologies | A21206, A11057 | 1:500 |
| Mounting medium, ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | toxic, work under fume hood |
References
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