מיקרוסקופית Intravital הדמיה של הכבד הבא<em> שושנת יריחו</em> זיהום: הערכה של פרמטרים המודינמיים בדיה
Summary
This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.
Abstract
מיקרוסקופיה intravital (IVM) היא טכניקת הדמיה אופטית רבת עוצמה שאפשרה את ההדמיה, הניטור והכימות של אירועים ביולוגיים שונים בזמן אמת ובבעלי חיים. טכנולוגיה זו התקדמה מאוד ההבנה של תהליכים פיסיולוגיים ותופעות בתיווך הפתוגן באיברים ספציפיים שלנו.
במחקר זה, IVM מוחל על כבד העכבר ופרוטוקולים נועדו תמונת in vivo מערכת הדם של הכבד ולמדוד תא דם אדום מהירות (RBC) בכלי כבד בודדים. כדי להמחיש את תת כלי שונה המאפיינים את האיבר הכבד ולבצע מדידות זרימת דם מהירות, C57Bl / 6 עכברים מוזרקים לוריד עם מגיב פלזמה ניאון שתוויות כלי הדם הקשורים בכבד. IVM מאפשר in vivo, בזמן אמת, מדידה של RBC מהירות בכלי ספציפי של עניין. הקמת מתודולוגיה זו תאפשר ללחקור פרמטרים המודינמיים כבד בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. סופו של דבר, מתודולוגיה מבוססת הדמיה זה תהיה חשובה ללימוד ההשפעה של ל ' זיהום donovani על פרמטרים המודינמיים בכבד.
שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מודלים זיהומיות אחרים ואיברי עכבר ועשויה להתארך עוד יותר לפרה-קלינית לבדיקה של ההשפעה של תרופה על ידי דלקת כימות השפעתו על זרימת דם.
Introduction
פרמטרים המודינמיים איברים ספציפיים הם תכונות פיסיולוגיות חשובות של כל איבר של יונקים. הפרעות בזרימת דם יכולות להיות התוצאה של דלקת וסימן לבעיות בתפקוד איבר 1. כך, זרימת דם ארגון, מבנה ותפקוד יופיעו פרמטרים קריטיים כמו לניתוח בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. הטכניקות שהיו בשימוש נפוץ לניתוח זרימת דם באיבר מסוים מכילות מספר מגבלות, כוללים מגבלת הרזולוציה של הטכניקה עצמה (למשל ההדמיה דופלר זרימת דם), היכולת למדידת זרימת דם מוחלטת בלבד (נפח דם ל יחידה משרתת איבר) (למשל טומוגרפיה אופטי קוהרנטיות) והמדידה של שינויים במהירות ממוצע באוכלוסייה גדולה והטרוגנית של כלי דם 2,3. מערכת הדם של כבד קישורים תת כלי שונה ההטרוגנית בגודל, המבנה והתפקוד שלהם. בטכנולוגיית הדמיה מחקר, מיקרוסקופיה intravital (IVM) זה מיושמת להעריך פרמטרים המודינמיים כבד in vivo, בזמן אמת, ברזולוציה גבוהה ובמקביל לחשוף את המאפיינים של כלי דם הבודדים המרכיבים את האיבר הכבד. הפיתוח האחרון של טכניקת הדמיה זה חזק אופטית מאפשר לחוקר לאסוף נתונים דינמיים בחי בעלי חיים ברזולוציה מרחב ובזמן גבוהה. כך שהוא מאפשר להדמיה הישירה וניטור בזמן אמת של תהליכים ביולוגיים ספציפיים ומהירים in vivo, IVM מספק הזדמנות ייחודית לחוקר לכלי דם בודד תמונה, ולמדוד ולכמת את המהירות של תאי דם אדומים יחידים (RBC) בתוך נבחר במיוחד כלי כבד.
במחקר זה, יישמנו את טכניקת IVM בכבד העכבר כדי לחקור את ההשפעה של זיהום על ידי עכבר טפיל שושנת יריחו hepatotropic על פרמטרים המודינמיים כבד. L. donovaniהוא הסוכן האחראי לleishmaniasis הקרביים, מחלה קשה המתאפיינת בתגובות דלקתיות חריפות-על-כרוני ופתולוגיה שנמצאת באיברים רבים, כולל הטחול והכבד. במודל עכבר ניסיוני של leishmaniasis הקרביים, דלקת הכבד היא ואילו זיהום הטחול הוא פרוגרסיבי 4 פתרון עצמי. תוצאות אלה של זיהום שושנת יריחו ביחס לאיברים הבודדים עדיין לא הבינו לגמרי. חקירה של פרמטרים המודינמיים כבד וטחול במצבים פתולוגיים תשפוך אור חדש על יחסי גומלין מארח-טפיל והיווצרות מחלה.
מערכת המודל הניסיונית שלנו מבוססת על חשיפה והדמית הכבד של עכבר הרדים שקיבל הזרקה תוך ורידית של צבעי ניאון ספציפיים לתיוג של intravasculature הכבד. הכבד הוא איבר חיובי למיקרוסקופיה פנים-חיונית. לאחר ביצוע incisio קטןn בבטן, הכבד מוחצנת בעדינות והניח על גזה רטובה, ולאחר מכן על coverslip עם המטרה של הפחתת כל חפצי תנועה בשל פעימות לב ונשימה. הכבד ממוקם אז במבט של עדשת מיקרוסקופ. בהשוואה לצומת הטחול והלימפה הדורשת השימוש בשני מיקרוסקופיה פוטון ללימודי IVM, היתרון של הכבד הוא בארכיטקטורת 3D הומוגנית / האנטומיה שלה, המאפשרת לשימוש במיקרוסקופ confocal קונבנציונלי, עם עומק חדירה מקסימאלי של כ 50 מיקרומטר, הדמיה מיקרוסקופיה intravital 5-8.
מחקר זה מתאר שתי שיטות הדמיה עצמאיות למדידת כמותית של מהירות וזרימת דם במהירות RBC בכלי דם בודדים. בשיטה הראשונה, זרימת דם בכבד נרכשה באמצעות מצב דו-ממדי XY לאורך זמן. נתונים xyt התוצאה מנותחים באמצעות תוסף MtrackJ בתוכנת ImageJ החופשית, המאפשר למעקב של individרע"מ RBCs לאורך זמן. בשיטה השנייה, כלי דם בודדים שנבחרו ואת זרימת הדם המתאים מנותחת באמצעות מצב רכישה מהירה סריקת קו של מיקרוסקופ לייזר סריקת confocal. הכלי של העניין נסרק בתדירות גבוהה לאורך הציר המרכזי שלה באמצעות קו צירי. זרימת דם המהירות אז לכמת מבוססת על ההבדל בניגוד בין אריתרוציטים כהים ללא תווית והפלזמה שכותרתו fluorescently. עוצמות הקרינה של תאי דם אדומים ופלזמה שנרכשו לאורך קו הסריקה הם זממו נגד זמן כדי להשיג פסים, הזוויות שלו הן פרופורציונליות למהירויות של RBC בודד.
מטרתו של מאמר זה היא לספק שיטה פשוטה לשחזור להדמיה ומדידת מהירות זרימת דם בתוך כלי דם בודדים של הכבד ולהפוך לזמינים את הכלים הבסיסיים לביצוע המוצלח של ניתוח עכבר, IVM וניתוחים כמותיים של המהירות RBCs הבודד. Tגישתו תאפשר לחוקרים כדי לקבל תובנות חדשות דם מהירות בתנאים פתולוגיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפיתוח האחרון של מיקרוסקופיה intravital של כבד העכבר פותח אפשרויות חדשות לחקירת תגובה הפיזיולוגית לזיהום in vivo ובזמן אמת 5,9,10. זרימת דם איברים היא פרמטר פיסיולוגי קריטי שבו לעתים קרובות שינה במחלות רבות. עם זאת, מעמדו של פרמטרים המודינמיים כבד בתנאים פיסיולוגיי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי INSERM, האוניברסיטה אקס-מרסיי ופרס פיתוח קריירה מHFSPO מתקבל על ידי CL פורסטייה.
Materials
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| BSA-Alexa 647 | lifetechnologies | A34785 | |
| Dextran-FITC 500 mol wt | SIGMA | 46947 | |
| Ketamine | PanPharma | 20434 | |
| Xylazine | Bayer | KP07KEU | |
| Vetedine | Pharma Animal | 6869029 | |
| Cyanoacrylate liquid | Cyanolit | 5833300005 | |
| Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013 | Molecular machines | 50103 | |
| Coverslip DiaPath 24×60 ep: 1.6 mm | DiaPath | 61061 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS-SP5 | |
| LAS-AF viewer | Leica software | Version 3.1.0 buid 8587 |
References
- Vollmar, B., Menger, M. D. The hepatic microcirculation: mechanistic contributions and therapeutic targets in liver injury and repair. Physiol. Rev. 89, 1269-1339 (2009).
- Srinivasan, V. Absolute blood flow measured by optical methods. SPIE Newsroom. , (2011).
- Seifalian, A. M., Stansby, G. P., Hobbs, K. E., Hawkes, D. J., Colchester, A. C. Measurement of liver blood flow: a review. HPB. Surg. 4, 171-186 (1991).
- Engwerda, C. R., Ato, M., Kaye, P. M. Macrophages, pathology and parasite persistence in experimental visceral leishmaniasis. Trends Parasitol. 20, 524-530 (2004).
- Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6, e1000805 (2010).
- Lee, W. Y., et al. An intravascular immune response to Borrelia burgdorferi involves Kupffer cells and iNKT cells. Nat. Immunol. 11, 295-302 (2010).
- Geissmann, F., et al. Intravascular immune surveillance by CXCR6+ NKT cells patrolling liver sinusoids. PLoS Biol. 3, e113 (2005).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat. protocols. 10, 258-268 (2015).
- Thiberge, S., et al. In vivo imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat. protocols. 2, 1811-1818 (2007).
- Vacchina, P., Morales, M. A. In vitro screening test using Leishmania promastigotes stably expressing mCherry protein. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 1825-1828 (2014).
- Ferrer, M., Martin-Jaular, L., Calvo, M., del Portillo, H. A. Intravital microscopy of the spleen: quantitative analysis of parasite mobility and blood. J. Vis. Exp. , (2012).
- Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nat. Methods. 7, 655-660 (2010).
- MacPhee, P. J., Schmidt, E. E., Groom, A. C. Intermittence of blood flow in liver sinusoids, studied by high-resolution in vivo microscopy. Am. J. Phys. 269, G692-G698 (1995).
