एसडीएफ-1α-Chitosan-dextran सल्फेट नैनोकणों की तैयारी और विशेषता
Summary
The objective of this protocol is to incorporate SDF-1α, a stem cell homing factor, into dextran sulfate-chitosan nanoparticles. The resultant particles are measured for their size and zeta potential, as well as the content, activity, and in vitro release rate of SDF-1α from the nanoparticles.
Abstract
Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under appropriate conditions. The glycan nanoparticles are useful carriers for protein factors, which facilitate the in vivo delivery of the proteins and sustain their retention in the targeted tissue. The glycan polyelectrolyte complexes are also ideal for protein delivery, as the incorporation is carried out in aqueous solution, which reduces the likelihood of inactivation of the proteins. Proteins with a heparin-binding site adhere to dextran sulfate readily, and are, in turn, stabilized by the binding. These particles are also less inflammatory and toxic when delivered in vivo. In the protocol described below, SDF-1α (Stromal cell-derived factor-1α), a stem cell homing factor, is first mixed and incubated with dextran sulfate. Chitosan is added to the mixture to form polyelectrolyte complexes, followed by zinc sulfate to stabilize the complexes with zinc bridges. The resultant SDF-1α-DS-CS particles are measured for size (diameter) and surface charge (zeta potential). The amount of the incorporated SDF-1α is determined, followed by measurements of its in vitro release rate and its chemotactic activity in a particle-bound form.
Introduction
Dextran सल्फेट (डी एस) और chitosan (सीएस) (डी एस में) एकाधिक एवजी नकारात्मक आरोप लगाया सल्फेट समूहों के साथ polysaccharides, या सकारात्मक आरोप लगाया एमाइन समूह हैं (सीएस deacetylated)। एक जलीय घोल में मिलाया है, जब दो polysaccharides electrostatic बातचीत के माध्यम से polyelectrolyte परिसरों के रूप में। जिसके परिणामस्वरूप परिसरों जलीय घोल (अवक्षेप) से चरण-अलग हो जाएगा कि बड़े समुच्चय, या पानी dispersible (कोलाइड) कर रहे हैं कि छोटे कणों फार्म कर सकते हैं। इन परिणामों के लिए योगदान है कि विशेष परिस्थितियों में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, और हाल ही में एक समीक्षा एक में संक्षेप और विस्तार में सचित्र किया गया है। इन स्थितियों के बीच, पानी dispersible कणों का निर्माण करने के लिए दो बुनियादी आवश्यकताओं oppositely आरोप लगाया पॉलिमर 1) काफी अलग दाढ़ बड़े पैमाने पर होगा रहे हैं; और 2) एक गैर stoichiometric अनुपात में मिलाया जा। इन स्थितियों के प्रभारी द्वारा उत्पन्न आरोप तटस्थ complexed बहुलक खंडों की अनुमति देगानिराकरण अलग और कण के मूल रूप में, और अतिरिक्त बहुलक बाहरी कवच एक फार्म करने के लिए। इस प्रोटोकॉल में वर्णित glycan कणों फेफड़े के वितरण के लिए इरादा कर रहे हैं, और नकारात्मक आरोप लगाया शुद्ध होने के लिए तैयार कर रहे हैं, और नैनोमीटर आयामों की। नकारात्मक सतह चार्ज कणों 2,3 के सेलुलर तेज करने की संभावना को कम कर देता है। नैनोमीटर आयाम के कण बाहर का एयरवेज के माध्यम से पारित होने की सुविधा। इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, इस तैयारी में इस्तेमाल डी एस की राशि सीएस से अधिक है (वजन अनुपात 3: 1); और उच्च आणविक वजन डी एस (वजन औसत से मेगावाट 500,000) और कम आणविक वजन सीएस (मेगावाट सीमा 50-190 केडीए, 75-85% deacetylated) का इस्तेमाल किया जाता है।
एसडीएफ-1α अपने chemotactic गतिविधि के माध्यम से घर वापस आना समारोह डाल रही है जो एक स्टेम सेल घर वापस आना कारक है। एसडीएफ-1α घर वापस आना और अस्थि मज्जा में hematopoietic स्टेम कोशिकाओं के रखरखाव में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और proge की भर्ती मेंचोट की मरम्मत 4,5 के लिए परिधीय ऊतकों को nitor कोशिकाओं। एसडीएफ-1α प्रोटीन प्रोटीज (CD26 / DPPIV) निष्क्रियता से संरक्षित किया जाना, हेपरिन / heparan सल्फेट, फार्म dimers करने के लिए बाध्य है, और कोशिका की सतह रिसेप्टर्स के माध्यम से लक्ष्य कोशिकाओं के साथ बातचीत करने की अनुमति देता है जो अपने प्रोटीन अनुक्रम में एक हेपरिन-बाइंडिंग साइट है 6-8। डी एस हेपरिन / heparan सल्फेट के रूप में इसी तरह के संरचनात्मक गुण है; इस प्रकार, डी एस के लिए एसडीएफ-1α के बंधन अपनी प्राकृतिक बहुलक ligands के समान होगा।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम एसडीएफ-1α-डी एस सी एस नैनोकणों की तैयारी का वर्णन है। प्रक्रियाओं 9 पहले अध्ययन किया गया है कि योगों में से एक का प्रतिनिधित्व करते हैं। प्रोटोकॉल मूल वीईजीएफ़-डी एस सी एस नैनोकणों 10 की एक जांच से अनुकूलित है। एक छोटे पैमाने पर तैयारी आसानी से एक ही शेयर समाधान और तैयारी शर्तों के साथ बढ़ाया जा सकता है, जो वर्णन किया गया है। तैयारी के बाद, कण ख विशेषता हैY उनके आकार, जीटा संभावित, एसडीएफ-1α समावेश की हद तक, इन विट्रो रिलीज के समय, और शामिल एसडीएफ-1α की गतिविधि की जांच।
Protocol
Representative Results
Discussion
जैसा कि ऊपर कहा, डी एस सी एस नैनोकणों polyanion (डी एस) और polycation (सीएस) के अणुओं के बीच आरोप निराकरण के माध्यम से बनते हैं। प्रभारी बातचीत आणविक टक्कर के दौरान आसानी से होता है, मिश्रण के दौरान बहुलक समाधान और सरगर?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HL671795, HL048743, और HL108630: यह काम एनआईएच अनुदान द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Name | Company | Catalog number |
| Dextran sulfate | Fisher | BP1585-100 |
| Chitosan, low molecular weight | Sigma | 448869 |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | 204986 |
| D-Mannitol | Sigma | M9546 |
| UltraPure water | Invitrogen | 10977-023 |
| SDF-1α | Prepared according to reference 8. | |
| Syringe filter, PES membrane 0.22 um. | Millipore | SLGP033RS |
| Magnetic Micro Stirring Bars (2 x 7 mm) | Fisher | 14-513-63 |
| Glass vial Kit; SUN-SRi | Fisher | 14-823-182 |
| Delsa Nano C Particle Analyzer | Backman Coulter | |
| Eppendorf UVette Cuvets | Eppendorf | 952010069 |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-Rad | 456-1096 |
| GelCode Blue Safe Protein Stain | Fisher | PI-24592 |
| Molecular Imager VersaDoc MP 4000 System | BioRad | 170-8640 |
| Corning Transwell Permeable Supports | Corning | 3421 |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Biosciences | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Sigma | D8537 |
| Pyrogent plus kit | Fisher | NC9753738 |
References
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