SDF-1α-キトサン硫酸デキストランナノ粒子の調製とキャラクタリゼーション
Summary
The objective of this protocol is to incorporate SDF-1α, a stem cell homing factor, into dextran sulfate-chitosan nanoparticles. The resultant particles are measured for their size and zeta potential, as well as the content, activity, and in vitro release rate of SDF-1α from the nanoparticles.
Abstract
Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under appropriate conditions. The glycan nanoparticles are useful carriers for protein factors, which facilitate the in vivo delivery of the proteins and sustain their retention in the targeted tissue. The glycan polyelectrolyte complexes are also ideal for protein delivery, as the incorporation is carried out in aqueous solution, which reduces the likelihood of inactivation of the proteins. Proteins with a heparin-binding site adhere to dextran sulfate readily, and are, in turn, stabilized by the binding. These particles are also less inflammatory and toxic when delivered in vivo. In the protocol described below, SDF-1α (Stromal cell-derived factor-1α), a stem cell homing factor, is first mixed and incubated with dextran sulfate. Chitosan is added to the mixture to form polyelectrolyte complexes, followed by zinc sulfate to stabilize the complexes with zinc bridges. The resultant SDF-1α-DS-CS particles are measured for size (diameter) and surface charge (zeta potential). The amount of the incorporated SDF-1α is determined, followed by measurements of its in vitro release rate and its chemotactic activity in a particle-bound form.
Introduction
デキストラン硫酸（DS）及びキトサン（CS）は、（CSを脱アセチル化）（DS）の複数の置換、負に帯電した硫酸基を有する多糖類である、又は正に帯電したアミン基を。水溶液中で混合する場合、2つの多糖類は、静電相互作用を介して高分子電解質複合体を形成する。得られた複合体は、水溶液（沈殿物）からの相分離、または水分散性（コロイド）である小さい粒子となり、大きな凝集体を形成することができる。これらの成果に貢献する具体的な条件は、広く研究されており、最近の総説1にまとめ、詳細に説明してきた。これらの条件の中で、水分散性粒子を製造するための2つの基本的な要件は反対に荷電したポリマーは、1）著しく異なるモル質量を持っている必要がある。 2）非化学量論比で混合する。これらの条件は、電荷によって発生した電荷中立複合化ポリマーセグメントを許可します中和は、分離し、粒子のコアを形成し、過剰なポリマーは、外殻1を形成するためである。このプロトコールに記載されたグリカン粒子は、肺送達のために意図され、負に帯電し、ナノメートル寸法の正味のように設計されている。負の表面電荷は、粒子2,3の細胞取り込みの可能性を低減する。ナノメートル寸法の粒子は、遠位気道の通過を容易にする。この目標を達成するために、この調製に用いられるDSの量は、CSの過剰である（重量比3：1）。及び高分子量DS（重量平均MW50万）および低分子量CS（MW範囲50から190 kDaの、75％〜85％脱アセチル化）が使用されている。
SDF-1αは、その走化性活性を通じてホーミング機能を発揮する幹細胞のホーミング因子である。 SDF-1αは、ホーミングおよび骨髄中の造血幹細胞の維持に重要な役割を果たし、progeの動員傷害の修復4,5のための末梢組織へnitor細胞。 SDF-1αタンパク質は、プロテアーゼ（CD26 / DPPIV）不活性化から保護され、ヘパリン/ヘパラン硫酸、フォームダイマーに結合し、細胞表面受容体を介して標的細胞と相互作用することができ、そのタンパク質配列において、ヘパリン結合部位を有する6-8。 DSはヘパリン/ヘパラン硫酸と同様の構造特性を持つ。このように、DSにSDF-1αの結合は、その天然高分子リガンドのものと同様であろう。
以下のプロトコールでは、SDF-1α-DS-CSナノ粒子の調製を記載する。手順は以前に9を検討されてきた製剤のいずれかを表す。プロトコルは、もともとVEGF-DS-CSナノ粒子10の調査から適合される。小規模調製物は、容易に同一のストック溶液と製造条件をスケールアップすることができ、記載されている。調製の後、粒子がbを特徴とするyは、それらのサイズ、ゼータ電位、SDF-1α取り込みの程度を、in vitroでの放出時間、及び組み込まれたSDF-1αの活性を調べる。
Protocol
Representative Results
Discussion
上記のように、DS-CSナノ粒子はポリアニオン（DS）及びポリカチオン（CS）分子間の電荷中和により形成される。電荷相互作用は、分子衝突の間に容易に起こるので、混合中のポリマー溶液と撹拌速度の濃度は、得られた粒子のサイズのために重要である。一般的な傾向は、よりDSとCSのソリューション15と、より小さい粒子より高い撹拌速度結果を希釈することである。
<p class="jove_…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HL671795、HL048743、およびHL108630：この作品は、NIHの助成金によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog number |
| Dextran sulfate | Fisher | BP1585-100 |
| Chitosan, low molecular weight | Sigma | 448869 |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | 204986 |
| D-Mannitol | Sigma | M9546 |
| UltraPure water | Invitrogen | 10977-023 |
| SDF-1α | Prepared according to reference 8. | |
| Syringe filter, PES membrane 0.22 um. | Millipore | SLGP033RS |
| Magnetic Micro Stirring Bars (2 x 7 mm) | Fisher | 14-513-63 |
| Glass vial Kit; SUN-SRi | Fisher | 14-823-182 |
| Delsa Nano C Particle Analyzer | Backman Coulter | |
| Eppendorf UVette Cuvets | Eppendorf | 952010069 |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-Rad | 456-1096 |
| GelCode Blue Safe Protein Stain | Fisher | PI-24592 |
| Molecular Imager VersaDoc MP 4000 System | BioRad | 170-8640 |
| Corning Transwell Permeable Supports | Corning | 3421 |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Biosciences | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Sigma | D8537 |
| Pyrogent plus kit | Fisher | NC9753738 |
References
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