3D modellering av sideventriklene og Histologisk Karakterisering av periventricular Tissue hos mennesker og mus

Summary

Using MRI scans (human), 3D imaging software, and immunohistological analysis, we document changes to the brain’s lateral ventricles. Longitudinal 3D mapping of lateral ventricle volume changes and characterization of periventricular cellular changes that occur in the human brain due to aging or disease are then modeled in mice.

Abstract

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional units of the ventricles are ciliated epithelial cells termed ependymal cells, which line the ventricles and through ciliary action are capable of generating laminar flow of CSF at the ventricle surface. This monolayer of ependymal cells also provides barrier and filtration functions that promote exchange between brain interstitial fluids (ISF) and circulating CSF. Biochemical changes in the brain are thereby reflected in the composition of the CSF and destruction of the ependyma can disrupt the delicate balance of CSF and ISF exchange. In humans there is a strong correlation between lateral ventricle expansion and aging. Age-associated ventriculomegaly can occur even in the absence of dementia or obstruction of CSF flow. The exact cause and progression of ventriculomegaly is often unknown; however, enlarged ventricles can show regional and, often, extensive loss of ependymal cell coverage with ventricle surface astrogliosis and associated periventricular edema replacing the functional ependymal cell monolayer. Using MRI scans together with postmortem human brain tissue, we describe how to prepare, image and compile 3D renderings of lateral ventricle volumes, calculate lateral ventricle volumes, and characterize periventricular tissue through immunohistochemical analysis of en face lateral ventricle wall tissue preparations. Corresponding analyses of mouse brain tissue are also presented supporting the use of mouse models as a means to evaluate changes to the lateral ventricles and periventricular tissue found in human aging and disease. Together, these protocols allow investigations into the cause and effect of ventriculomegaly and highlight techniques to study ventricular system health and its important barrier and filtration functions within the brain.

Introduction

En ependymal cellemonolag linjer ventrikkel systemet i hjernen som gir toveis barriere og transportfunksjoner mellom cerebrospinalvæsken (CSF) og interstitiell væske (ISF) ^1-3. Disse funksjonene bidrar til å holde hjernen giftstoffet frie og i fysiologisk balanse ^2,3. Hos mennesker tap av deler av denne foring på grunn av skade eller sykdom synes ikke å resultere i regenerativ erstatning som finnes i andre epitel foringer; heller tap av ependymal celle dekning synes å resultere i periventricular astrogliosis med en nettvare av astrocytter som dekker områder ribbet for ependymal celler ved ventrikkelen overflaten. Alvorlige konsekvenser på viktige CSF / ISF valutakurser og rydnings mekanismer ville bli spådd å skyldes tap av denne epitellaget ^1,2,4-7.

Et fellestrekk ved menneskelig aldring er forstørret sideventriklene (ventriculomegaly) og tilhørende periventricular ødem som observatøred ved MR og væske svekket inversjon recovery MR (MRI / FLAIR) ^8-14. For å undersøke forholdet mellom ventriculomegaly og mobil organisering av ventrikkelen fôr, ble postmortem menneskelige MR sekvenser matchet med histologiske preparater av lateral ventrikkel periventricular vev. I tilfeller av ventriculomegaly, hadde betydelige områder av gliose erstattet ependymal celle dekning langs side ventrikkel veggen. Når ventrikkel utvidelse ikke ble oppdaget av MRI-baserte volumanalyse, den ependymal celleforingen var intakt og gliose ble ikke påvist langs ventrikkel fôr ^6. Dette kombi tilnærming representerer de første omfattende dokumentasjon detaljering endringer i cellulær integritet laterale ventrikkel fôr bruker wholemount preparater av deler eller hele laterale ventrikkel vegg og 3D modellering av ventrikkel volumer ^6. Flere sykdommer (Alzheimers sykdom, schizofreni) og skader (traumatisk hjerneskade)vise ventriculomegaly som en tidlig nevropatologiske trekk. Denudasjon områder av ependymal celleforingen dermed ville bli spådd å forstyrre normal ependymal cellefunksjon og kompromittere homeostatic balanse mellom CSF / ISF væske og oppløst stoff utveksling. Dermed vil en grundigere undersøkelse av endringer i ventrikkel systemet, dets cellulære sammensetningen, og konsekvensen til underliggende eller nabo strukturer i hjernen til slutt begynne å avsløre mer om nevropatologi forbundet med ventrikkel utvidelse.

Mangelen på multimodale bildedata, særlig langsgående datasekvenser sammen med begrenset tilgang til tilsvarende histologiske vevsprøver gjør analyse av humane hjernesykdommer vanskelig. Modellering fenotyper funnet i menneskelig aldring eller sykdom kan ofte oppnås med musemodeller og dyremodeller blitt en av våre beste middel til å utforske spørsmål om menneskelig sykdom initiering og progresjon. Flere studier påfriske unge mus har beskrevet cytoarchitecture av laterale ventrikkel vegger og underliggende stamcelle nisje ^4,7-15. Disse studiene har blitt utvidet til å inkludere 3D-modellering og cellulær analyse av ventrikkelen veggene gjennom aldring ^6,15. Verken periventricular gliose heller ventriculomegaly er observert hos eldre mus, snarere mus viser en relativt robust subventicular sone (SVZ) stamcelle nisje underliggende til en intakt ependymal celle fôr ^6,15. Således slående artsspesifikke forskjeller i både generelt vedlikehold og integriteten av den laterale ventrikkel slimhinnen i løpet av aldringsprosessen ^6,15. Derfor, for å sikre best mulig utnyttelse mus å avhøre betingelser som finnes hos mennesker, forskjeller mellom de to artene må være preget og hensiktsmessig betraktes i enhver modellering paradigme. Her presenterer vi rutiner for å evaluere langsgående endringer i sideventriklene og tilhørende periventricular vev i både mennesker og mOuse. Våre prosedyrer inkluderer 3D-gjengivelse og volumetri av både mus og menneske ventriklene, og bruk av immunhistokjemisk analyse av hele mount preparater av periventricular vev for å karakterisere både mobilnettet organisering og struktur. Sammen danner disse fremgangsmåtene gir et middel til å karakterisere endringer i det ventrikulære systemet og tilhørende periventricular vev.

Protocol

MERK: Animal prosedyrene ble godkjent av University of Connecticut IACUC og i samsvar med NIH retningslinjer. Menneskelig vev og dataanalyse og prosedyrer var i samsvar med og godkjent av University of Connecticut IRB og i samsvar med NIH retningslinjer. 1. Mus: Analyse av periventricular Cellular Integritet og 3D modellering av Lateral ventrikkel 1.1) Fremstilling av Muse lateral ventrikkel Vegg Hele Mounts Forbered muse laterale ventrikkel hele mounts f…

Representative Results

Contour sporing av muse sideventriklene basert på immunostained 50 mikrometer koronalsnitt og 3D rekonstruksjoner (figur 3) gjør volumdata skal samles i ulike eksperimentelle paradigmer bruker mus som modellsystem for sykdom eller skade. Kritisk for denne prosedyren er utelukkelse av områder der de laterale ventrikkel veggene holder seg til hverandre. Ved subsegmenting regioner i ventriklene og utpeke en annen farge for hver region (Figur 3C), kan sammenhengende seksjoner holdes og r…

Discussion

Vi presenterer verktøy og protokoller som kan brukes til å evaluere integriteten av hjernens ventrikulære system i mus og i mennesker. Disse verktøyene kan imidlertid også anvendes på andre strukturer i hjernen eller organsystemer som gjennomgår endringer som skyldes skade, sykdom eller under aldringsprosessen ^14,21,22. Strategiene presenteres dra nytte av programvare som gjør justeringen av tverrsnitt og langsgående MR sekvenser for å generere 3D volum representasjoner av spesifikke regioner eller …

Materials

Name of the Materal/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Phosphate buffered saline (PBS)	Life Technologies	21600-069
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences	19210	Use at 4% in PBS, 4 °C
Normal Horse Serum	Life Technologies	16050	10% in PBS-TX (v/v)
Normal Goat Serum	Life Technologies	16210	10% in PBS-TX (v/v)
Triton X-100 (TX)	Sigma-Aldrich	T8787	0.1% in PBS (v/v)
Vibratome	Leica	VT1000S
Fluorescence Microscope	Zeiss	Imager.M2
Camera	Hamamatsu	ORCA R2
Microscope Stage Controller	Ludl Electronic Products	MAC 6000
Stereology software	MBF Bioscience	Stereo Investigator 11
Stereology software	ImageJ/NIH	NIH freeware
3D Reconstruction software	MBF Bioscience	Neurolucida Explorer
Confocal Microscope	Leica	TCS SP2
MRI Software
Freesurfer	https://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/DownloadAndInstall		Segmentation and Volume
ITK-Snap	http://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.php		Segmentation and Volume
Multi-image Analysis GUI (Mango)	http://ric.uthscsa.edu/mango/		Longitudinal overlay
Whole Mount Equipment
22.5° microsurgical straight stab knife	Fisher Scientific	NC9854830
parafilm
wax bottom dissecting dish
pins
fine forceps
aquapolymount
Dissecting Microscope	Leica	MZ95
Whole Mount Antibodies
mouse anti-b-catenin	BD Bioschiences, San Jose, CA, USA		1:250
goat anti-GFAP	Santa Cruz Biotechnology		1:250
rabbit anti-AQP4 (aquaporin-4)	Sigma-Aldrich		1:400
Coronal Antibodies
Anti-S100β antibody	Sigma-Aldrich		1:500
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Life Technologies	D-1306	10 µg/mL in PBS