Tecniche di lavorazione occhi impiantati con una retina Protesi per Localized istopatologico Analysis: Part 2 epiretinica impianti con retina aderenze

Summary

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

Abstract

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.

Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.

Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

Introduction

Retinite pigmentosa (RP) è una malattia ereditaria che provoca perdita diffusa dei fotorecettori, che sono le cellule nello strato più esterno della retina responsabile trasduzione luce, sotto forma di fotoni, in attività neurale. È importante sottolineare che i pazienti con RP hanno tipicamente neuroni residui negli altri strati della loro retina che sono ancora funzionali. Protesi retiniche sono in grado di ripristinare una certa visione limitata a questi pazienti di mira questi neuroni superstiti con stimolazione elettrica per attivare il loro percorso di ^1,2 visiva. Esiti percettivi da studi clinici hanno mostrato promettenti risultati iniziali e recentemente alcuni dispositivi sono stati approvati per l'uso commerciale. Attualmente, ci sono tre principali sedi anatomiche in cui sono state posizionate le protesi retiniche clinici: epiretinally ^{3,4, 5,6} e subretinally suprachoroidally ^7,8. Dispositivi diversi utilizzano diversi materiali e la loro forma è personalizzatoalla posizione in cui sono impiantati. Tuttavia, tutti creano percezioni visive attivando i neuroni residui della retina con impulsi elettrici.

Vi è la possibilità di qualsiasi protesi mediche per danneggiare il tessuto circostante a causa di effetti meccanici del collocamento iniziale o successive forze in corso. In caso di stimolatori impiantabili, quali protesi retiniche, vi è la considerazione aggiuntiva che i parametri elettrici devono essere entro limiti di sicurezza. La sicurezza del paziente è fondamentale, quindi i dispositivi deve essere rigorosamente testato in studi preclinici prima di passare alla creazione di una clinica ^9-15. Nel nostro articolo compagno, abbiamo descritto un metodo per la valutazione della istopatologia localizzata dell'occhio circostante un impianto posizionato nello spazio sovracoroideale ^16. Nel presente manoscritto, si descrive una tecnica per la visualizzazione dei tessuti oculari che circonda una matrice di elettrodi appiccicato alla retina epiretinally, in un preclinico (feline) Modello (Figura 1).

La posizione epiretinal è la posizione più comunemente utilizzato per localizzare una protesi visiva. Array elettrodi situati qui sono tipicamente apposte alla retina con una virata metallo che penetra tutti gli strati dell'occhio ^17-20. Prima le tecniche descritte nella presente manoscritto era difficile valutare con precisione la retina e altri tessuti immediatamente circostanti una virata. Fissazione dell'occhio standard con formalina tamponata neutra provocato danni alla retina artefatta a causa del movimento differenziale della retina e sclera contro il punto fisso della mura. Pertanto i danni reali causati dalla virata e la matrice epiretinal non poteva essere osservato con precisione. Inoltre, sezionando il tessuto oculare non poteva essere eseguita con l'aderenza della retina in situ come oggetti metallici non possono essere isolate con le apparecchiature tradizionali istologica; rimuovere la virata prima della trasformazione istologica era ancheindesiderabile in quanto ciò ha comportato anche danni alla retina artefatta.

Lo scopo del presente studio è stato duplice: 1) per ridurre il distacco della retina manufatto in modo che eventuali danni causati dalla virata e l'array dell'impianto epiretinal può essere valutato in modo attendibile; e 2) per visualizzare l'architettura retinica adiacente al tatto senza rimuoverla. Per raggiungere obiettivo 1, una nuova tecnica di fissaggio è stata utilizzata (come descritto nell'articolo guidata ^16), che riduce artefatti delaminazione retinica. Al fine di conseguire l'obiettivo 2, abbiamo modificato un embedding, rettifica, e la tecnica, originariamente sviluppato per l'osservazione in situ di cocleari elettrodi impianto ^21-23 lucidatura. I metodi descritti in questo manoscritto consentono la visualizzazione della retina circostante e adiacente ad una virata in situ, riducendo al minimo i danni della retina artefatta e consentendo quindi una valutazione accurata di eventuali danni causati dalla virata e la matrice epiretinal.

Protocol

NOTA: Tutte le procedure sono state approvate dal Royal Victorian Eye and Ear Research & Ethics Comitato Animal Hospital (RVEEH AEC; # 10-199AB). I soggetti sono stati trattati secondo il National Health e "Codice di condotta australiano per la cura e l'uso di animali a scopi scientifici" del Medical Research Council (2013) e la "Prevenzione della Crudeltà verso gli Animali Act" (1986; e modifiche). Tutte le procedure di valutazione e di elettrofisiologia chirurgiche, cliniche sono state effettuate sotto anestesia e sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo le sofferenze. 1. enucleazione e Fixation NOTA: Seguire la procedura enucleazione e la fissazione descritto in dettaglio nel manoscritto compagno di 16, facendo attenzione in più verso cavi di dispositivi o porte vitrectomia, se presente. Brevemente, ciò comporta: Transcardiaca profumato il soggetto con soluzione salina calda seguita da buffe neutra a freddoformalina rosso. Legare suture al bulbo oculare per servire come punti di riferimento. Enucleare l'occhio 16, mantenendo i cavi del dispositivo e qualsiasi attacco patch / schede. Post-fix l'occhio in soluzione di Davidson per 18 – 36 ore. Trasferimento al 50% di etanolo per 6 – 8 ore. Trasferimento a 70% di etanolo e conservare in frigorifero (4 ° C) fino dissezione. 2. Rimozione elettrodi e dissezione. NOTA: Non tutti gli impianti epiretiniche avranno lo stesso fattore di forma, ma in generale ci sarà un array di elettrodi e una qualche forma di materiale di supporto flessibile e adattabile. I dispositivi che sono collocati assieme alla retina presentano un foro in cui il tack tack metallo penetra la matrice e la parte posteriore dell'occhio, mantenendo queste insieme. Visualizzate l'impianto e il punto in cui è fissato alla retina. Utilizzando una lama di 15 gradi fa un'incisione trans-corneale circonferenziale e togliere il tappo corneale a expose l'iride e lente sottostanti. Utilizzando una lama 15 gradi, il disinserimento fibre zonular della lente e rimuovere la lente in toto, esponendo camera posteriore con l'impianto e il epiretinal tack metallo in situ. A seconda dell'impianto e lo studio in corso di esecuzione, rimuovere i componenti estranei prima di ulteriori dissezione. NOTA: Nel presente esempio, l'array epiretinal corso di valutazione costituito da un elettrodo di diamante ermetica pacchetto ed elettronica prototipo ospitato all'interno di un vettore di silicone conforme (prodotto in casa, vedi 20). Qui, estrarre con cautela il pacchetto elettrodo diamante da dissezione fine con un bisturi. Lasciare il corpo silicone dell'impianto insieme al tack retina e resti del cablaggio di platino (Figura 2). Se un array / contenitore incorporato non è parte del design del dispositivo in esame, quindi omettere questo passaggio (2.2). Attentamentesezionare un campione che comprende l'aderenza e tessuto circostante nell'orientamento desiderato. Usare bene le forbici dissezione per tagliare le strisce di spessore pieno dalla parte posteriore dell'occhio, tra cui sclera, coroide e della retina. Prelevare un campione, che dà una sezione longitudinale del tack, che mostra tutti gli strati retinici adiacenti alla tack (Figura 2) NOTA: L'orientamento desiderato per il campione può variare a seconda del particolare risultato desiderato. Ad esempio, se si vuole esaminare la vicinanza del danno virata al disco ottico poi il disco ottico deve essere inclusa nel campione. 3. Disidratazione, Embedding, montaggio, Macinare, colorazione, e Imaging Disidratare il campione in tre giorni in fasi progressive di etanolo: Disidratare il campione in etanolo al 70% per 2 ore due volte. Disidratare il campione in 80% di etanolo per 2 ore due volte e poi O / N. Disidratare il campione in etanolo al 90% per 2 ore TWICe. Disidratare il campione in 100% di etanolo per 2 ore due volte e poi O / N. Disidratare il campione in 100% acetone per 2 ore due volte. Togliere il campione dal acetone e osservare al microscopio luce che aria-asciuga a temperatura ambiente. Trasferire il campione di resina epossidica (fare riferimento al punto 3.4) poco prima che inizi ad arricciarsi / crollo. NOTA: La rimozione del liquido dai tessuti molli risultati in cellule crollati e ritiro. Un apprezzamento di quando si verifica l'arricciatura del tessuto / crollo è sviluppato con l'esperienza. Preparare resina epossidica grado medico secondo le istruzioni del produttore. Per curare la resina, utilizzare 55 ° C per 1 ora o 24 ore a RT. Porre in una camera a vuoto per ~ 5 min a ~ 50 mbar per la rimozione di bolle d'aria. Regolare il vuoto manualmente come un vuoto eccessivo causerà la miscela epossidica a bollire e degasaggio non si verifichi effettivamente NOTA: Eseguire il passaggio 3.3 in concomitanza con la fase 3.2. Incorpora la sample in resina epossidica trasparente. Immergere il tessuto oculare in resina epossidica degasata in un apposito contenitore sigillabile e lasciare O / N a RT per curare. Fare attenzione a incorporare il campione con l'orientamento desiderato (Figura 2) ridimensionando e ri-embedding blocco resina catalizzata. Re-incorporare il blocco ridimensionata contenente il tessuto oculare tale che l'asse lungo della mura è orientato parallelamente al fondo dello stampo (giallo tazza – Figura 3A). Montare la resina in supporto del campione di macinazione e macinare il campione (230-250 giri con acqua, rettifica manuale) con carta carburo di silicio (a partire da 800 rete; Figure 3C e 3E). Per la colorazione, immergere la superficie del terreno in toluidina colorazione blu per 3-5 minuti, o fino a quando si sviluppa macchia (Figura 3F). Risciacquare con acqua di rubinetto (Figura 3G). Immagine la superficie del terreno del campione con una portata elevata potenza dissezione per visualizzare gli strati cellulari delretina (Figura 3H). Applicare una goccia di acqua distillata sulla superficie superiore della resina epossidica sopra il campione per lisciare la diffrazione all'interfaccia aria-epossi. Utilizzare una fibra 'collo d'oca' sorgente luminosa ottica per illuminare il campione. Ripetere i passaggi 3,6-3,9, ogni tempo di macinazione di distanza uno spessore prefissato di campione (minimo incremento molatura preciso e riproducibile di portacampioni è 20 micron).

Representative Results

Il protocollo di fissaggio ridotto sensibilmente il distacco artefatta e delaminazione della retina 16. Orientamento del campione all'interno del blocco epossidica è stata ottenuta costantemente usando il processo incorporamento due fasi descritto. La procedura di rettifica incrementale richiesto un livello moderato di destrezza manuale per ottenere risultati ottimali, ma è stata aiutata dal titolare del campione regolabile che ha fornito un controllo preciso della risoluzione incremento. In tutti i casi (n = 5) l'aderenza era situato e terra / lucidata con risultati desiderabili e coerenti. La retina adiacente alle puntine erano risolvibili e macchiato in modo appropriato. Lucidatura la superficie del blocco di resina epossidica con un grado P # 800 carta al carburo di silicio era sufficiente per l'immagine macrostruttura cellulare del tessuto incorporato. Carta di grado superiore, o diamante liquami possono essere utilizzati per lucidare ulteriormente la superficie in qualsiasi data profondità se desiderato. Un microscopio dissezione e fibra ottica 'collo d'oca' lighfonte t è risultato essere adatto per l'imaging la superficie del blocco di terra e il campione di tessuto incorporato. La posizione della sorgente di luce è stata variata per tentativi per trovare una posizione e angolo che ha dato il miglior illuminazione e contrasto attraverso il microscopio. Aggiunta di una goccia d'acqua distillata alla superficie del blocco, sopra il campione, era utile per ridurre la luce di diffrazione percorso e / o distorsioni lisce all'interfaccia epossidico. Figura 4 mostra esempio immagini di tessuto retinico visualizzate immediatamente adiacente ad una retina di titanio virare utilizzando questa tecnica. Non artefatta distacco della retina e pieghevole può essere visto su entrambi i lati del silicone (Figura 4A). L'albero tack è visibile incorporato in silicone; la testa del tack è penetrato retina e sclera. C'è non artefatta distacco di retina nella retina macchia lati del silicone (Figura 4C). La tecnica ha mostrato che, in questo caso, there è disorganizzazione retinica adiacente alla aderenza e la compressione della retina da un lato a causa di un angolo di inserimento obliquo. Si noti che le immagini presentate sono meramente illustrazioni del successo della tecnica, non rappresentativi della tack-danni istopatologia in generale. Figura 1. Posizionamento di una matrice di elettrodi epiretinal. (A) Schema dell'occhio che mostra una sezione trasversale ingrandita del posteriore sclera, coroide e retina degenerata (privo fotorecettori). Un array di elettrodi è rappresentato in blu, apposto epiretinally. (B) Computer-aided-disegno di un array di elettrodi epiretinal. un circuito integrato ('chip') e il pacchetto elettrodi; b, titanio tack retina; c, custodia in silicone per uso medico; d, punto di uscita piombo. Pannello A modificato da un illustrati originalisu gentile concessione di Bionic Vision Australia, autore Beth Croce. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 2. Rimozione degli elettrodi e la dissezione dell'occhio. Alta gamma dinamica fotografie macro di un occhio felino enucleato con tack epiretinal in situ. (A) Condividi fissazione con fissativo di Davidson per preservare l'architettura della retina 16, l'occhio enucleato è stato sezionato. Il pacchetto matrice di elettrodi è stato rimosso dal supporto di silicone (tratteggiata contorno quadrato indica posizione originale di matrice di elettrodi) con la tack (freccia) ed il corpo di silicone dell'impianto restante. (B) L'occhio è stato sezionato con la sezione longitudinale adiacente bordeggiare(Linea tratteggiata). La virata resta incorporato nella parete posteriore del oculare (freccia), stabilizzato prevalentemente dalla sclera. La sezione di tessuto contenente il tack è stato preparato per incorporamento resina e macinazione (segmento destra), mentre la sezione contenente retina sotto la matrice di elettrodi rimosso è stato preparato per l'elaborazione istologica campione 16 (segmento a sinistra). Un righello con incrementi di 0,5 millimetri è mostrato sul bordo inferiore di ogni pannello. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 3. embedment epossidica e rettifica della mura e tessuto retinico. Fotografie della resina epossidica integrata e campione di tessuto allineati, rettifica, colorazione e di imaging della mura e tessuto retinico. (A) La tac k campione è stato incorporato in un blocco di resina epossidica. Utilizzando lo stampo, il campione è stato orientato in modo che il piano longitudinale è parallelo al fondo dello stampo. (B) Il blocco resina catalizzata contenente il campione tack. (C) Il blocco epossidica è stato montato in un portacampioni molatura, pronto per la macinazione . (D) Il campione è stato orientato in modo imaged sezioni del tessuto terra contengono gli strati cellulari retinici e l'asse longitudinale del tack. (E) Il campione è stato macinato con carta carburo di silicio su un macinino rotativo. (F) La superficie terra il blocco è stato macchiato con toluidina blu per identificare gli strati retinici. (G) Il blocco è stato lavato in acqua di rubinetto per rimuovere l'eccesso macchia. (H) La toluidina blu macchiati strati retinici e virata sono stati ripresi utilizzando una portata elevata dissezione potenza. annuncio / 52.348 / 52348fig4highres.jpg "/> Figura 4. immagini di potenza alta e bassa della virata e della retina. In vari punti durante le immagini di processo di macinazione sono state scattate con un ambito dissezione, mostrando sezioni longitudinali della virata (asterisco) che penetrano attraverso l'occhio e in uscita la sclera ('S' ), adiacente silicone (hash) e blu di toluidina macchiato e retina senza macchia ('R'). Nota questi sono esempi di immagini solo per dimostrare la presenza tecnica di visualizzazione, e non sono rappresentative di tutti di impianto o tack risultati istologici inserimento epiretiniche. Resti di terra del cablaggio platino sono visibili in pannelli AD ('W'). (A) a basso consumo, immagine senza macchia della mura penetrare la retina e sclera. (B) Immagini di alta potenza del distacco della retina e pieghevole in retina senza macchia adiacente al vettore silicone immagine A. (C) immagine a bassa potenza in al centro dell'albero tack. <strong> (D) Immagine di alta potenza del centro tack nell'immagine C. (E) In un campione separato, con nessun vettore silicone, viene mostrata una immagine di alta potenza di blu di toluidina retina macchiato sotto l'impugnatura tack, immediatamente prima rettifica l'albero virata (F) toluidina Normale blu macchiato architettura retina (GCL: strato di cellule gangliari della retina; INL: strato nucleare interno; ONL: strato nucleare esterno; PR: fotorecettori; T: felino tapetum lucidum). visualizzata utilizzando la stessa tecnica di rettifica . Barre di scala in ogni pannello sono: A e C = 2 mm B e D = 500 micron; E = 200 micron; F = 100 micron.

Discussion

Tecniche istologiche standard sono in grado di elaborare le protesi in metallo duro in situ a causa di limitazioni nel taglio di questi oggetti di metallo, vetro o anche dischi diamantati. Nel nostro compagno di carta ^16, abbiamo dimostrato che l'uso di una tecnica di fissazione intero-eye modificato potrebbe ridurre artefatti delaminazione della retina. Nel manoscritto corrente, un consolidato smerigliatura e lucidatura tecnica per la visualizzazione di impianti cocleari ^21-23 in situ è stato modificato per protesi retiniche. Una virata di titanio, utilizzato per proteggere una matrice di elettrodi alla retina, epiretinally, è stato incorporato in resina epossidica con il tessuto oculare circostante. Questo blocco di resina è stata poi orientato in modo appropriato e terra / progressivamente lucido per rivelare la morfologia del tessuto immediatamente adiacente alla virata di metallo. Immagini della superficie lucida del blocco a varie profondità sono state prese con un potente microscopio di dissezione. Questa tecnica è utile per: Visualizzazione e evaluating la risposta del tessuto adiacente all'impianto epiretinal; per valutare il trauma chirurgico associato con l'impianto della protesi; per determinare la reazione biologica ai componenti in metallo duro; e per misurare la distanza tra l'impianto e la superficie della retina.

Questa tecnica sarà utile in studi di sicurezza per future in situ visualizzazione della regione adiacente ad una virata retina o altri (ad esempio metallico) oggetti duri nell'occhio. Questo ha applicazione diretta nella valutazione della sicurezza preclinica di protesi virato alla retina epiretinally. Può anche essere utile per valutare il danno tissutale in regioni retina a contatto con impianti situati in posizione sub-retinica.

Ci sono diversi modi per verificare che la tecnica è stata eseguita correttamente. In ogni fase, la retina dovrebbe rimanere aderente agli strati esterni dell'occhio. Se vi è il distacco di retina artefatta lordo, ciò può indianemangiato un problema con il fissaggio. Quando il campione è incorporato e ri-orientato nella resina finale bloccare la retina deve essere vicino ortogonale alla faccia di macinazione del blocco; Questo ridurrà al minimo il taglio obliquo. È utile per verificare che il numero di passaggi di macinazione incrementali (noto di step size) necessaria per attraversare un oggetto (quale un tack retinica) correlare conseguenza con le dimensioni dell'oggetto.

La tecnica può essere ottimizzato in diversi modi. Graffi sulla superficie del blocco epossidica associato al processo di macinazione possono essere ridotti con progressiva lucidatura grado più fine. Per questo studio, abbiamo utilizzato 800, 1000, 1200, 2400, e 4000 carta al carburo di silicio. Pasta diamante potrebbe essere utilizzato anche per migliorare la finitura superficiale. Una finitura superficiale più fine dà un'immagine di qualità superiore, ma a costo di tempo lucidatura supplementare. Un'altra considerazione importante per migliorare l'esito di questa tecnica è la scelta e la qualità del optics e l'illuminazione utilizzati per la cattura delle immagini. Altre macchie istologiche di base – in particolare le macchie di Nissl, possono essere utilizzati al posto del blu di toluidina, ma potrebbero richiedere un'ulteriore ottimizzazione. Alcuni macchie si macchia la resina e il tessuto (ad esempio, eosina), quindi uno smalto superficiale può essere richiesto dopo la colorazione per rimuovere sfondo scolorimento. Macchie specializzati, coloranti fluorescenti e colorazione immunoistochimica non è stato tentato, ma a meno che un risultato molto specifica è desiderato, il tempo richiesto per eseguire queste macchie a ciascun livello di macinazione è probabile che sia proibitivi. Tuttavia, può essere possibile macchiare il tessuto nel suo insieme prima della fase di incorporamento (passo 3.4) ^24.

Il limite principale di questa tecnica è che una volta che la regione di interesse è stato macinato distanza, non può essere recuperato, pertanto, è prudente catturare molte immagini (eventualmente ridondanti) in una varietà di ingrandimenti in ogni fase di levigatura e lucidatura. Èanche importante utilizzare piccoli incrementi per ogni regolazione della profondità di macinazione. Un altro limite di questa tecnica è che la ingrandimento ottico e risoluzione rispetto a tessuto montato su un vetrino e visualizzato con uno standard (trasmissione) microscopio ottico. Ai fini della prototipazione e valutazione della sicurezza di un dispositivo di impianto romanzo, la valutazione patologica lordo è di interesse primario. Questa tecnica offre un metodo efficiente per osservare i danni clinicamente rilevanti associati con una virata retina. Con la pratica, il tempo complessivo necessario per raccogliere grind, polacco e fotografare un dato campione (una volta integrati) è paragonabile al tempo che ci vuole per la sezione di un blocco di paraffina o sezioni congelate.

Vi è anche la possibilità per le attuali tecniche per essere esteso alle applicazioni al di fuori dell'ambito di impianti retinici. Questa tecnica è adatta per valutare il tessuto adiacente ad un impianto fisso, in cui l'estrazione dell'impianto non feasible o danneggerebbero l'interfaccia. Ad esempio, questa tecnica può essere espansa per valutare protesi in metallo (ad esempio, platino, nitinol, etc.) che non può essere tagliato con tecniche istologiche convenzionali, come alcuni cerebrale profonda o elettrodi nervose periferiche, cannule per la somministrazione di farmaci, stent vascolari o protesi ortopediche.

Materials

Name of the reagent / equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Acetone	Chem-Supply	AA008	Propanone BHD Medical grade
Epo-Tek 301 Epoxy	Epoxy Technology	Part A 1675-54-3 Part B 9046-10-0
Ethanol 70-75% v/v	Merck PTY LTD	4.10261	Alcohol
Ethanol	Merck PTY LTD	90143	Alcohol
Toluidine blue O	Sigma-Aldrich	T3260
Ethylenediamine Tetraacetic Acid	Sigma-Aldrich
TegraPol grinding/polishing machine	Struers	TegraPol-25
AccuStop specimen holder	Struers	Accustop
Light microscope	Leica	MZ16
Objective lens	Leica	2.0x Planapo Objective
Digital Microscope Camera	Leica	DFC-420C
Microscope Software	Leica	Application Suite v4.1.0