Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.
Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.
Retinitis pigmentosa (RP) är en ärftlig sjukdom som orsakar omfattande förluster av fotoreceptorer, som är de celler i det yttersta lagret av näthinnan som ansvarar för att omvandla ljus, i form av fotoner, i neural aktivitet. Viktigt patienter med RP har vanligtvis rest nervceller i de andra lagren i deras näthinnan som fortfarande funktionell. Retinal proteser är kapabla att återställa viss begränsad vision att dessa patienter genom att rikta dessa överlevande nervceller med elektrisk stimulering för att aktivera sin visuella väg 1,2. Perceptuella utfall från kliniska prövningar har visat lovande tidiga resultat och nyligen vissa enheter har godkänts för kommersiell användning. För närvarande finns det tre huvudsakliga anatomiska platser där kliniska retinala proteser har positione: epiretinally 3,4, subretinally 5,6 och suprachoroidally 7,8. Olika enheter använder olika material och deras form är anpassadtill den plats där de är implanterade. Men de har alla skapar visuella percepts genom att aktivera de kvarvarande neuronerna i näthinnan med elektriska pulser.
Det finns potential för någon medicinsk protes att skada omgivande vävnad på grund av mekaniska effekter av den initiala placeringen eller efterföljande pågående krafter. I fallet med implanterbara stimulatorer, såsom retinal proteser, det finns det tilläggsköpeskilling att de elektriska parametrarna ska vara inom säkra gränser. Patientsäkerhet är av största vikt, så enheterna måste vara rigoröst testade i prekliniska studier innan avancera till en klinisk inställning 9-15. I vår följeslagare artikel beskrev vi en metod för att bedöma den lokaliserade histopatologi av ögat som omger ett implantat placeras i suprakoroidala utrymmet 16. I föreliggande manuskript beskriver vi en teknik för visualisering av ögonvävnad som omger elektrodbäraren uppsatt på näthinnan epiretinally, i en preklinisk (feline) modell (Figur 1).
Den Epiretinal platsen är den mest utnyttjade läge för att lokalisera en visuell protes. Elektrod arrayer belägna här är normalt fästs på näthinnan med en metall please som penetrerar alla lager i ögat 17-20. Före de tekniker som beskrivs i föreliggande manuskript var det svårt att exakt bedöma retinal och andra vävnader som omedelbart omger en klibb. Standardögonfixering med neutralt buffrad formalin gav arte retinal skada på grund av den differentiella rörelsen av näthinnan och sklera mot den fasta punkten på klibb. Därför någon faktisk skada som orsakats av klibbighet och Epiretinal array inte kunde exakt observeras. Dessutom kunde sektioneögonvävnaden inte utföras med näthinnans klibb in situ såsom metallföremål inte lätt kan skäras med traditionell histologisk anordningen; avlägsna please innan histologiska behandling var ocksåönskvärt eftersom detta ledde också till artefaktuell retinal skador.
Syftet med den aktuella studien var tvåfaldigt: 1) att minska näthinneavlossning artefakt så att skada som orsakats av halshornet och Epiretinal implantat array tillförlitligt kan bedömas; och 2) att visualisera näthinnan arkitekturen intill please utan att ta bort den. För att uppnå målet 1, var en ny bindningsteknik används (enligt beskrivningen i följeslagare artikel 16), vilket minskar arte retinal delaminering. För att uppnå målet 2, modifierad vi en inbäddning, slipning och polering teknik, som ursprungligen utvecklades för in situ observation av cochleaimplantat elektroder 21-23. De metoder som beskrivs i detta manuskript tillåter visualisering av näthinnan som omger och intill ett slag på plats samtidigt minimera arte retinal skada och därmed möjliggör noggrann bedömning av eventuella skador som orsakats av klibbighet och Epiretinal array.
Standard histologiska tekniker kan inte behandla hårdmetallimplantat på plats på grund av begränsningar i att skära dessa objekt med metall, glas eller ens diamantklingor. I vår följeslagare papper 16, visade vi att användningen av en modifierad hel-eye bindningsteknik kan minska arte retinal delaminering. I den aktuella manuskriptet, en etablerad slipning och polering teknik för att visualisera cochleaimplantat 21-23 på plats var modifierade för retinal proteser. En titan klibb, används för att säkra en elektroduppsättning till näthinnan, epiretinally, inbäddades i epoxi tillsammans med den omgivande ögonvävnad. Denna hartsblocket därefter orienterad på lämpligt sätt och successivt slipas / poleras för att avslöja den vävnadsmorfologi omedelbart intill metall klibb. Bilder av den polerade ytan hos blocket vid olika djup togs med en kraftfull dissektionsmikroskop. Denna teknik är användbar för: visualisering och evaluating vävnadssvaret intill den Epiretinal implantatet; att bedöma den kirurgiska trauma i samband med implantationen av implantatet; för att bestämma den biologiska reaktionen till hårdmetallkomponenterna; och för att mäta avståndet mellan implantatet och ytan av näthinnan.
Denna teknik kommer att vara användbart i framtida säkerhetsstudier för in situ visualisering av området intill en retinal klibb eller andra hårda (t.ex. metall) objekt i ögat. Detta har direkt tillämpning i bedömningen av prekliniska säkerhets av proteser uppsatt på näthinnan epiretinally. Det kan också vara användbart för att utvärdera vävnadsskada i retinala regioner i kontakt med implantaten belägna i sub-retinala läge.
Det finns flera sätt att kontrollera att tekniken har utförts på rätt sätt. Vid varje steg, bör näthinnan förbli fäst till de yttre skikten av ögat. Om det finns grov arte näthinneavlossning, kan detta Indicåt ett problem med fixering. När provet är inbäddad och omorienteras i det slutliga hartset blockera näthinnan ska vara nära ortogonala med slip ansikte av blocket; Detta kommer att minimera snedskärning. Det är nyttigt att kontrollera att antalet enskilda slipsteg (med känd stegstorlek) som krävs för att passera ett objekt (till exempel en retinal please) korrelerar således med dimensionerna av objektet.
Tekniken kan optimeras på flera sätt. Repor på ytan av epoxi blocket associerat med slipprocessen kan reduceras med progressivt finare polering. För föreliggande studie använde vi 800, 1000, 1200, 2400, och 4000 kiselkarbid papper. Diamant pastan skulle också kunna användas för att förbättra ytfinishen. En finare ytfinish ger högre bildkvalitet, men till priset av ytterligare polering tid. En annan kritisk fråga för att förbättra resultatet av denna teknik är valet och kvaliteten på optics och belysning som används för bildfångst. Andra grundläggande histologiska fläckar – särskilt Nissl fläckar, kan användas i stället för toluidinblått, men kan kräva ytterligare optimering. Vissa fläckar färgar hartset liksom vävnaden (t.ex. eosin), alltså en grund polish kan krävas efter färgning för att ta bort bakgrunds missfärgning. Specialiserade fläckar, fluorescerande färger och immunhistokemisk färgning inte försökt, men om ett mycket specifikt resultat önskas, kommer sannolikt att vara oöverkomliga den tid som krävs för att utföra dessa fläckar vid varje slipning nivå. Det kan emellertid vara möjligt att färga vävnaden som helhet före inbäddning steget (steg 3.4) 24.
Den största begränsningen med denna teknik är att när regionen av intresse har slipas bort, det kan inte hämtas, därför är det klokt att fånga många (möjligen redundanta) bilder på en mängd olika förstoringar i varje skede av slipning och polering. Det ärockså viktigt att använda små steg för varje slipning djupjustering. En annan begränsning hos denna teknik är att den optiska förstoringen och upplösning jämfört med vävnad monterad på ett objektglas och betraktades med en standard (transmission) ljusmikroskop. Vid tillämpning av prototyper och bedöma säkerheten hos en ny implantatanordning, är den patologisk utvärdering av primärt intresse. Denna teknik tillhandahåller en effektiv metod för att observation kliniskt relevant skada som associeras med en retinal klibb. Med övning, den totala tid som krävs för att samla grind, polska och fotografera ett givet prov (en gång inbäddade) är jämförbar med den tid det skulle ta att avsnittet en paraffinblock eller fryst avsnitt.
Det finns också potential för de nuvarande teknikerna som ska utvidgas till att ansökningarna inte omfattas av retinala implantat. Denna teknik lämpar sig för att utvärdera vävnaden intill en hård implantat, där implantat extraktion är inte feasible eller skulle skada gränssnittet. Till exempel, skulle denna teknik kunna utvidgas för att utvärdera implantat gjorda av metall (t.ex. platina, nitinol, etc.) som inte kan skäras med konventionella histologiska tekniker, såsom några djupa hjärnan eller perifera nervelektroder, kanyler för läkemedelstillförsel, vaskulära stentar eller ortopediska proteser.
The authors have nothing to disclose.
Nicole Vella (Macquarie University) for providing reagents; Alexia Saunder (Bionics Institute; BI), Michelle McPhedran (BI), Chris Williams (BI) for experimental support; the Royal Victorian Eye and Ear Hospital (RVEEH) Biological Research Centre staff for animal care; Sue Pierce (RVEEH) for veterinary advice; Anthony Burkitt (Bionic Vision Australia; BVA), Tamara Brawn (BVA) and the BVA staff for administrative support.
This research was supported by the Australian Research Council (ARC) through its Special Research Initiative (SRI) in Bionic Vision Science and Technology grant to Bionic Vision Australia (BVA). The Bionics Institute receives Operational Infrastructure Support from the Victorian Government and also acknowledges support from the Bertalli Family Trust and the J T Reid Charitable Trust. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
The Bionic Vision Australia Consortia authors for this manuscript are (a-z):
Penelope J. Allen, Owen Burns, Kate E. Fox, Kumaravelu Ganesan, David J. Garret, Hamish Meffin, Joel Villalobos, and Jonathan Yeoh.
Name of the reagent / equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Acetone | Chem-Supply | AA008 | Propanone BHD Medical grade |
Epo-Tek 301 Epoxy | Epoxy Technology | Part A 1675-54-3 Part B 9046-10-0 | |
Ethanol 70-75% v/v | Merck PTY LTD | 4.10261 | Alcohol |
Ethanol | Merck PTY LTD | 90143 | Alcohol |
Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
Ethylenediamine Tetraacetic Acid | Sigma-Aldrich | ||
TegraPol grinding/polishing machine | Struers | TegraPol-25 | |
AccuStop specimen holder | Struers | Accustop | |
Light microscope | Leica | MZ16 | |
Objective lens | Leica | 2.0x Planapo Objective | |
Digital Microscope Camera | Leica | DFC-420C | |
Microscope Software | Leica | Application Suite v4.1.0 |