אלקטרו ומורפולוגי אפיון של שבבים עצביים במוח חריף Slices שימוש מותאם Patch-קלאמפ הקלטות
Summary
Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.
Abstract
השילוב של הקלטות מהדק תיקון משני (או יותר) נוירונים בשילוב synaptically (הקלטות לזווג) בהכנות פרוסה מוח חריפות עם מילוי biocytin תאיים בו זמנית מאפשר ניתוח מתואם של התכונות המבניות והתפקודיות שלהם. בשיטה זו אפשר לזהות ולאפיין את שני נוירונים טרום postsynaptic על ידי המורפולוגיה שלהם ודפוס תגובת אלקטרו. הקלטות לזווג מאפשרות ללמוד את דפוסי הקישוריות בין תאי העצב האלה, כמו גם את המאפיינים של שני שידור סינפטי הכימי וחשמלי. הנה, אנחנו נותנים תיאור צעד-אחר-צעד של ההליכים הנדרשים להשגת הקלטות לזווג אמינות יחד עם התאוששות אופטימלית של מורפולוגיה תא העצב. אנו מתארים כיצד זוגות של הנוירונים המחוברים דרך סינפסות כימיות או צמתים פער מזוהים בהכנות פרוסה מוח. אנו מתארים כיצד תאי עצב משוחזרים להשיג מורפולוגיה 3D של dendritic ותחום axonal ואיך הסינפטי קשר מזוהה ומקומי. נדונו גם באזהרות ומגבלות של טכניקת ההקלטה לזווג, בפרט אלה הקשורים לtruncations הדנדריטים וaxonal במהלך תקופת ההכנה של פרוסות המוח כי אלה חזקים משפיעים הערכות קישוריות. עם זאת, בגלל הרבגוניות של גישת ההקלטה לזווג הוא יישאר כלי רב ערך באפיון היבטים שונים של העברת הסינפטית בשבבים עצביים מזוהים במוח.
Introduction
שבבים עצביים בין שני תאי עצב בשילוב synaptically הם אבני הבניין של רשתות בקנה מידה גדולה במוח והם היחידות הבסיסיות של עיבוד מידע הסינפטי. תנאי מוקדם לאפיון של שבבים עצביים כזו הוא לדעת את המורפולוגיה ותכונות פונקציונליות של שני נוירונים השותף טרום postsynaptic, הסוג של החיבור הסינפטי (ים) ואת המבנה שלה ומנגנון תפקודי. עם זאת, במחקרים רבים של קשרים סינפטיים לפחות אחד מתאי העצב בmicrocircuit אינו מאופיין היטב. זה נובע מפרוטוקולי הגירוי יחסית הנוקבים המשמשים לעתים קרובות במחקרים של קישוריות הסינפטי. לכן, התכונות המבניות ותפקודיות של נוירון presynaptic הם גם לא זיהו כלל או רק במידה קטנה למדי (כלומר, הביטוי של חלבוני סמן וכו '). הקלטות מותאמים בשילוב עם מכתים תאיים על ידי סמנים שלuch כמו biocytin, Neurobiotin או צבעי ניאון מתאים יותר ללימוד שבבים עצביים קטנים. טכניקה זו מאפשרת לחקור פרמטרים רבים מבניים ותפקודיים של חיבור הסינפטי זיהה מורפולוגית באותו הזמן.
מה שנקרא חיבורים 'אחידים' monosynaptic בין שני תאי עצב נחקרו בשני אזורים במוח בקליפת המוח וקורטיקליים 1-10 באמצעות הכנות פרוסה חריפות. בתחילה, microelectrodes החדה שימשה בניסויים אלה; מאוחר יותר, הקלטת מהדק התיקון הועסקה כדי להשיג הקלטות של אותות הסינפטי עם רמת רעש נמוכה ורזולוציה של זמן השתפרה.
מראש טכניים משמעותיים היה השימוש בניגוד להפרעות ההפרש אינפרא אדום (IR-DIC) אופטיקה 11-14, טכניקה מיקרוסקופית ששיפרה באופן משמעותי את הנראות וזיהוי של תאי עצב במוח הפרוסה כך שהוא הפך t האפשריo להשיג הקלטות מקשרים סינפטיים מזוהים מבחינה ויזואלית 15-17. באופן כללי, הקלטות לזווג נעשות בהכנות פרוסה חריפות; רק מעט מאוד פרסומי הקלטות דיווח זמינות מהנוירונים מחוברים synaptically in vivo 18-20.
היתרון החשוב ביותר של הקלטות לזווג הוא העובדה שאפיון פונקציונלי יכול להיות משולב עם ניתוח מורפולוגי בשני האור ורמה מיקרוסקופית אלקטרונים (ראה, למשל., 7,16,21). לאחר עיבוד histochemical, המורפולוגיה הדנדריטים וaxonal של זוג נוירון מחובר synaptically היא לייחס. בהמשך לכך, ניתן לכמת תכונות מורפולוגיות כגון אורך, צפיפות מרחבית, אורינטציה, הסתעפות דפוס וכו 'פרמטרים אלה עשויים לאחר מכן לספק בסיס לסיווג אובייקטיבי של קשר הסינפטי ספציפי. יתר על כן, בניגוד לרוב הטכניקות אחרות המשמשות ללימוד connecti העצביהקלטות vity, לזווג גם לאפשר זיהוי של קשרים סינפטיים לקשרים סינפטיים יחידתי. ניתן לעשות זאת ישירות באמצעות שילוב של אור ומיקרוסקופ אלקטרונים 16,21-27 או באמצעות ההדמיה סידן 28,29 של קוצים הדנדריטים. עם זאת, עם הגישה השנייה רק מעורר אבל ניתן ללמוד לא קשרים מעכבים כפי שהוא דורש זרימת סידן באמצעות ערוצי קולט postsynaptic.
בנוסף לניתוח מפורט של העברת הסינפטית בהקלטות microcircuit לזווג עצביות מוגדרות גם לאפשר המחקר של כללי פלסטיות הסינפטית 30,31 או – בשילוב עם יישום אגוניסט / אנטגוניסט – האפנון של שידור סינפטי על ידי נוירוטרנסמיטרים כגון אצטילכולין 32 ואדנוזין 33.
Protocol
Representative Results
Discussion
הקלטות לזווג ממעורר בשילוב synaptically ו / או נוירונים מעכבים הן גישה מאוד תכליתית ללימוד שבבים עצביים. לא רק בגישה זו אינה מאפשרת אחד כדי להעריך קישוריות הסינפטי בין סוגי תאי עצב, אלא גם מאפשרת קביעת המאפיינים הפונקציונליים של החיבור והמורפולוגיה של תאי עצב טרום postsynaptic. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank all members of ‘Function of Neuronal Microcircuits’ Group at Institute of Neuroscience and Medicine, INM-2, Research Centre Jülich and the ‘Function of Cortical Microcircuits’ Group in the Dept. of Psychiatry, Psychotherapy and Psychosomatics, Medical School, JARA, RWTH Aachen University for fruitful discussions. This work was supported by the DFG research group on Barrel Cortex Function (BaCoFun).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifier | HEKA | EPC 10 USB Triple | with 2-3 preamplifiers |
| Microscope | Olympus | BX51WI | with 2 camera ports and a 4× objective, a 40× water-immersion objective |
| Camera | TILL Photonics | VX55 | infrared CCD camera |
| Workstation | Luigs & Neumann | Infrapatch 240 | with a motorized x-y stage and a motorized focus axis for the microscope |
| Micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-5 | x-y-z manipulators for 2-3 preamplifiers |
| Faraday cage | Luigs & Neumann | ||
| Anti-vibration table | Newport Spectra-Physics | ||
| Patchmaster | HEKA | ||
| Microtome | Microm International | HM650V | |
| Micropipette puller | HEKA | Sutter P-97 | |
| Neurolucida system | Microbrightfield | with Neurolucida and Neuroexplorer softwares |
References
- Hughes, G. M., Tauc, L. A direct synaptic connexion between the left and right giant cells in Aplysia. J Physiol. 197 (3), 511-527 (1968).
- Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons. Science. 213 (4510), 898-901 (1981).
- Miles, R. Synaptic excitation of inhibitory cells by single CA3 hippocampal pyramidal cells of the guinea-pig in vitro. J Physiol. 428 (1), 61-77 (1990).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations and LTP. Science. 252 (5006), 722-724 (1991).
- Mason, A., Nicoll, A., Stratford, K. Synaptic transmission between individual pyramidal neurons of the rat visual cortex in vitro. J Neurosci. 11 (1), 72-84 (1991).
- Thomson, A. M., West, D. C. Fluctuations in pyramid-pyramid excitatory postsynaptic potentials modified by presynaptic firing pattern and postsynaptic membrane potential using paired intracellular recordings in rat neocortex. Neuroscience. 54 (2), 329-346 (1993).
- Buhl, E. H., Halasy, K., Somogyi, P. Diverse sources of hippocampal unitary inhibitory postsynaptic potentials and the number of synaptic release sites. Nature. 368 (6474), 823-828 (1994).
- Bolshakov, V. Y., Siegelbaum, S. A. Regulation of hippocampal transmitter release during development and long-term potentiation. Science. 269 (5231), 1730-1734 (1995).
- Debanne, D., Guerineau, N. C., Gahwiler, B. H., Thompson, S. M. Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures. J Neurophysiol. 73 (3), 1282-1294 (1995).
- Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16 (4), 815-823 (1996).
- MacVicar, B. A. Infrared video microscopy to visualize neurons in the in vitro brain slice preparation. J Neurosci Methods. 12 (2), 133-139 (1984).
- Dodt, H. U., Zieglgansberger, W. Visualizing unstained neurons in living brain slices by infrared DIC-videomicroscopy. Brain Res. 537 (1-2), 333-336 (1990).
- Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflugers Arch. 423 (5-6), 511-518 (1993).
- Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled cortical and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat Protoc. 3 (10), 1559-1568 (2008).
- Gulyas, A. I., et al. Hippocampal pyramidal cells excite inhibitory neurons through a single release site. Nature. 366 (6456), 683-687 (1993).
- Silver, R. A., Lubke, J., Sakmann, B., Feldmeyer, D. High-probability uniquantal transmission at excitatory synapses in barrel cortex. Science. 302 (5652), 1981-1984 (2003).
- Biro, A. A., Holderith, N. B., Nusser, Z. Quantal size is independent of the release probability at hippocampal excitatory synapses. J Neurosci. 25 (1), 223-232 (2005).
- Crochet, S., Chauvette, S., Boucetta, S., Timofeev, I. Modulation of synaptic transmission in neocortex by network activities. Eur J Neurosci. 21 (4), 1030-1044 (2005).
- Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
- Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Deep cortical layers are activated directly by thalamus. Science. 340 (6140), 1591-1594 (2013).
- Markram, H., Lubke, J., Frotscher, M., Roth, A., Sakmann, B. Physiology and anatomy of synaptic connections between thick tufted pyramidal neurones in the developing rat neocortex. J Physiol. 500 (Pt 2), 409-440 (1997).
- Gray, E. G. Axo-somatic and axo-dendritic synapses of the cerebral cortex: an electron microscope study). J Anat. 93 (Pt 4), 420-433 (1959).
- Uchizono, K. Characteristics of excitatory and inhibitory synapses in the central nervous system of the cat). Nature. 207 (997), 642-643 (1965).
- Tamas, G., Buhl, E. H., Lorincz, A., Somogyi, P. Proximally targeted GABAergic synapses and gap junctions synchronize cortical interneurons. Nat Neurosci. 3 (4), 366-371 (2000).
- Feldmeyer, D., Lubke, J., Silver, R. A., Sakmann, B. Synaptic connections between layer 4 spiny neurone-layer 2/3 pyramidal cell pairs in juvenile rat barrel cortex: physiology and anatomy of interlaminar signalling within a cortical column. J Physiol. 538 (Pt 3), 803-822 (2002).
- Feldmeyer, D., Lubke, J., Sakmann, B. Efficacy and connectivity of intracolumnar pairs of layer 2/3 pyramidal cells in the barrel cortex of juvenile rats). J Physiol. 575 (Pt 2), 583-602 (2006).
- Helmstaedter, M., Staiger, J. F., Sakmann, B., Feldmeyer, D. Efficient recruitment of layer 2/3 interneurons by layer 4 input in single columns of rat somatosensory cortex). J Neurosci. 28 (33), 8273-8284 (2008).
- Oertner, T. G., Sabatini, B. L., Nimchinsky, E. A., Svoboda, K. Facilitation at single synapses probed with optical quantal analysis. Nat Neurosci. 5 (7), 657-664 (2002).
- Koester, H. J., Johnston, D. Target cell-dependent normalization of transmitter release at neocortical synapses. Science. 308 (5723), 863-866 (2005).
- Markram, H., Lubke, J., Frotscher, M., Sakmann, B. Regulation of synaptic efficacy by coincidence of postsynaptic APs and EPSPs. Science. 275 (5297), 213-215 (1997).
- Egger, V., Feldmeyer, D., Sakmann, B. Coincidence detection and changes of synaptic efficacy in spiny stellate neurons in rat barrel cortex. Nat Neurosci. 2 (12), 1098-1105 (1999).
- Eggermann, E., Feldmeyer, D. Cholinergic filtering in the recurrent excitatory microcircuit of cortical layer 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (28), 11753-11758 (2009).
- Feldmeyer, D., van Aerde, K. I., Qi, G. . Society for Neuroscience. , 335.313 (2012).
- Radnikow, G., Gunter, R. H., Marx, M., Feldmeyer, D., Fellin, T., Halassa, M. . Neuronal Network Analysis : Concepts and Experimental Approaches. 67, 405-431 (2012).
- Feldmeyer, D., Egger, V., Lubke, J., Sakmann, B. Reliable synaptic connections between pairs of excitatory layer 4 neurones within a single ‘barrel’ of developing rat somatosensory cortex. J Physiol. 521 (Pt 1), 169-190 (1999).
- Koelbl, C., Helmstaedter, M., Lubke, J., Feldmeyer, D. A Barrel-Related Interneuron in Layer 4 of Rat Somatosensory Cortex with a High Intrabarrel Connectivity). Cereb Cortex. , (2013).
- Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
- Biro, A. A., Holderith, N. B., Nusser, Z. Release probability-dependent scaling of the postsynaptic responses at single hippocampal GABAergic synapses. J Neurosci. 26 (48), 12487-12496 (2006).
- Huang, C. H., Bao, J., Sakaba, T. Multivesicular release differentiates the reliability of synaptic transmission between the visual cortex and the somatosensory cortex. J Neurosci. 30 (36), 11994-12004 (2010).
- Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500 (7461), 168-174 (2013).
- Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
- Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Laminar sources of synaptic input to cortical inhibitory interneurons and pyramidal neurons. Nat Neurosci. 3 (7), 701-707 (2000).
- Schubert, D., et al. Layer-specific intracolumnar and transcolumnar functional connectivity of layer V pyramidal cells in rat barrel cortex. J Neurosci. 21 (10), 3580-3592 (2001).
- Schubert, D., Kotter, R., Zilles, K., Luhmann, H. J., Staiger, J. F. Cell type-specific circuits of cortical layer IV spiny neurons. J Neurosci. 23 (7), 2961-2970 (2003).
- Schubert, D., Kotter, R., Luhmann, H. J., Staiger, J. F. Morphology, electrophysiology and functional input connectivity of pyramidal neurons characterizes a genuine layer va in the primary somatosensory cortex. Cereb Cortex. 16 (2), 223-236 (2006).
- Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks. Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).
- Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Fine-scale specificity of cortical networks depends on inhibitory cell type and connectivity. Nat Neurosci. 8 (11), 1552-1559 (2005).
- Shepherd, G. M., Svoboda, K. Laminar and columnar organization of ascending excitatory projections to layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex. J Neurosci. 25 (24), 5670-5679 (2005).
- Bureau, I., von Saint Paul, F., Svoboda, K. Interdigitated paralemniscal and lemniscal pathways in the mouse barrel cortex. PLoS Biol. 4 (12), e382 (2006).
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10 (5), 663-668 (2007).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
- Adesnik, H., Scanziani, M. Lateral competition for cortical space by layer-specific horizontal circuits. Nature. 464 (7292), 1155-1160 (2010).
- Molnar, Z., Cheung, A. F. Towards the classification of subpopulations of layer V pyramidal projection neurons. Neurosci Res. 55 (2), 105-115 (2006).
- Doyle, J. P., et al. Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types. Cell. 135 (4), 749-762 (2008).
- Brown, S. P., Hestrin, S. Intracortical circuits of pyramidal neurons reflect their long-range axonal targets. Nature. 457 (7233), 1133-1136 (2009).
- Groh, A., et al. Cell-type specific properties of pyramidal neurons in neocortex underlying a layout that is modifiable depending on the cortical area. Cereb Cortex. 20 (4), 826-836 (2010).
- Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr Opin Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).
