Proteoliposome 기반 유출 분석은 CL의 단일 분자의 속성을 확인하는 - 채널 및 전송기

Summary

Proteoliposomes는 잘 정의된 생화학적 환경에서 재구성된 정제된 채널과 수송체를 연구하는 데 사용됩니다. 이러한 단백질에 의해 매개되는 유출을 측정하기 위한 실험적 절차가 설명됩니다. 프로테오리포좀을 준비하고, 기록을 수행하고, 데이터를 분석하여 재구성된 단백질의 기능적 특성을 정량적으로 결정하는 단계가 설명됩니다.

Abstract

지난 15년 동안 진핵생물뿐만 아니라 원핵생물로부터 막 단백질을 과발현하고 정제하는 능력이 폭발적으로 증가한 것이 특징입니다. 이러한 증가는 주로 막 단백질에 대한 구조 정보를 얻으려는 성공적인 노력에 의해 주도되었습니다. 그러나 이러한 단백질을 기능적으로 조사하는 능력은 동일한 속도로 발전하지 않았으며 종종 제한된 정량적 가치의 정성적 분석으로 제한되어 제공할 수 있는 기계론적 통찰력을 제한합니다. 재구성된 Cl^-채널 또는 수송체의 수송 활성을 정량적으로 조사하기 위한 분석법이 설명됩니다. 이 분석은 막 전위를 션트하기 위해 K⁺ ionophore valinomycin을 추가한 후 프로테오리포좀에서 Cl^-의 유출 속도를 측정한 것을 기반으로 합니다. 이온 민감성 전극은 원하는 단백질로 재구성된 프로테오리포좀에서 이온 유출의 시간 경과를 추적하는 데 사용됩니다. 이 방법은 단일 수송 속도, 활성 단백질의 분율 및 기능 단위의 분자량과 같은 재구성된 단백질의 주요 특성을 정량적으로 결정할 수 있기 때문에 기계론적 연구에 매우 적합합니다. 이 분석은 또한 재구성된 단백질을 직접 억제/활성화하는 저분자 화합물의 효과를 결정하고 멤브레인 조성 또는 지질 변형 시약의 조절 효과를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 가능한 경우, 이 방법을 사용하여 얻은 결과를 직접 비교하는 것이 전기생리학적 접근 방식을 사용하여 얻은 결과와 잘 일치하는 것으로 나타났습니다. 이 기술은 CLC 유형 H ⁺ / Cl^- 교환기 인 CLC-ec1을 모델 시스템으로 사용하여 설명됩니다. 유출 분석은 모든 Cl 전도성 채널/수송체를 연구하는 데 사용할 수 있으며, 최소한의 변화로 모든 이온 수송 단백질을 연구하는 데 적용할 수 있습니다.

Introduction

마지막 두 과발현과 막 수송 단백질을 정제 할 수있는 능력이 크게 증가하고있다 수십 년 : 이온 채널, 일차 및 이차 전송기들은 보통 이종 발현 시스템뿐만 아니라, 천연 공급원으로부터 정제된다. 이 단백질의 안정성을, 표현을 모니터링 개선하고 추출을 용이하게하고 강화하는 새로운 접근 방식은 끊임없이 ^1-5 개발되고있다. 이러한 기술 혁신은 차례로, 그 기능의 구조적 기지에 대한 우리의 이해를 강화, 막 단백질에 원자 수준의 구조 정보의 폭발을 유발하는 데 큰 도움이되고있다. 반면에, 우리의 능력은 어떤 경우에는 고해상도 구조적 정보가 따라서 정량적 구조 기반 예측을 테스트 할 수있는 능력을 제한 질적 기능 데이터에 의해 수반되도록, 동일한 비율로 증가하지 않은 정제 된 단백질의 기능적 특성을 프로빙. 따라서, developmen는양적 일반화 기능 분석의 t는 막 단백질의 기능 기계론 토대 해명 향해 중요한 단계이다.

채널 및 전송기 ^{- 준비} 정량적 정제하고 재구성 CL의 주요 기능적 특성을 결정하기 위해 사용될 수 유출 분석을 기술한다. 분석을위한 원칙은 교통 시스템뿐만 아니라 다양한 비 이온 수송 단백질로 일반화 될 수있다. 채널 / CL 대형의 존재 수송차 ^{- -} 정제 된 리포....

Protocol

1. 지질 준비

1. 투명 유리 튜브로 원하는 양의 지질 나누어지는. 사용 E. 콜라이 극성 지질 추출물하지만 대부분 지질 조성물을 사용할 수있다. 지질이 분말 형태 인 경우, 20 ㎎ / ㎖의 농도로 이들을 클로로포름에 재현 탁. 모든 용매가 증발 할 때까지 N ₂ 가스에서 RT에서 지질을 건조.
2. 펜탄의 지질을 재현 탁 클로로포름의 남은 흔적을 제거하기 위해 다시 가스 N _2를 일정하게 건조시킨다. 드라이 모든 용매를 증발 할 때까지. 건조 동안 지질이 아래쪽 형성 치밀한 질량보다는 튜브의 아래쪽을 덮는 제 균일 한 막 분포되도록 부드럽게 회전 튜브.
3. 재구성 버퍼 함유 세제를 추가 (300 mM의 KCl을 50 mM의 시트르산, 25 mM의 K ₂ HPO _4의 pH 4.5, 35 mM의 CHAPS)은 지질을 용해. 단백질이 CHAPS에 가난하게 허용하는 경우이 단계에서 다른 중성 세제를 사용하십시오.
4. Resuspen물 목욕 초음파기를 사용하여 선명도 지질 거라고. 짧은 (30 초 - 1 분)와 짧은 (30 초 - 1 분) 펄스를 최대 전력에서 물 초음파기 목욕의 중심에 튜브를 담가 일시 중지합니다. 이 솔루션은 명확하게해야한다.....

Results

교환기, 리포좀에 재구성 ^- 정제 CLC-EC1, 원핵 CLC 형 H ⁺ / CL에 의해 매개 교통 ^- 우리는 상세하고 강력한 CL을 측정 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 실험 장치의 개략적 인 대표도도 3에 도시되어 정제 된 CLC-EC1 및 높은 내부 CL 함유 재구성은 테오 ^-. 낮은 CL 함유 용액 욕에 침지 ^-. 이러한 조건 그물 CL에서 ^- 유출은 리포좀 (그림 3A)에 양의 전하의 축적에 의해 방지 할 수있다. 유출 (그림 3B) ^- 발리 노마 이신 (Valinomycin)의 추가는 K ^+가 막 따라서 전위 전철과 CL을 시작 가로 질러 이동할 수 있습니다. 플럭스 시간 코스는 CL을 사용하여 모니터된다 ^- -selective 전극 및 CL의 총량 .......

Discussion

정제 음이온 선택적 채널 또는 리포좀에 재구성 수송에 의해 매개 교통 ^- 우리는 상세한 CL을 측정 할 수있는 프로토콜을 설명했다. CLC-EC1을 기 ^- 사용 된 예는 원핵 H ⁺ / CL이었다. 고려중인 이온에 적합한 하나의 AgCl 전극 : 그러나, 방법론 용이 리간드 ^{12,13,15, 11,12} 전압 또는 AG로 대체하여 다른 음이온 선택성 ^{15,16 스포츠} 의해 게이트 된 채널을 연구하기에 적합 할 수있다. 전극이 CL 이외의 이온에 대한 선택적 ^- 이러한 H의 ^+로, I ^- F는 ^-, 상업적으로 사용할 수 있습니다.

중요한 단계 및 가정의 몇 가지의 토론은 다음과 같습니다.

푸 아송 희석 가정의 한계

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
지방살균제, Avanti Polar Lipids Inc.	아반티 폴라 지질 Inc.	610200
IEC Centra CL2 벤치탑	Thermo Scientific
Orion Research Model 701A 디지털 pH-mV 미터			이들은 Ebay에서 찾을 수 있습니다.
작동하지 않는 pH 프로브			은색 와이어가 있는 모든 pH 측정기 프로브가 작동합니다. 유리/플라스틱 코팅을 제거하고 전선을 청소해야 합니다.
DI-710 데이터 로거	DATAQ 기기
WinDAQ 수집 소프트웨어	DATAQ 기기
피어스 일회용 플라스틱 기둥, 중력 흐름, 2ml	피어스(Thermo Scientific)	29922
KIMAX 배양 튜브, 일회용, 붕규산 유리	Kimble Chase	73500-13100
홀더/가열 블록	이 있는 압출기 세트아반티 폴라 지질 Inc.	610000
컴퓨터