En Proteoliposome-Based Efflux analys för att bestämma enda molekyl egenskaper Cl<sup> -</sup> Kanaler och Transportörer
Summary
Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.
Abstract
The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl– channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl– from proteoliposomes following the addition of the K+ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H+/Cl– exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl– conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.
Introduction
I senaste två decennierna förmågan att överuttrycker och rena membrantransportproteiner har dramatiskt ökat: jonkanaler, primära och sekundära transportörer nu rutinmässigt renas från heterologa expressionssystem samt naturliga källor. Nya metoder för att övervaka uttryck, förbättra och underlätta utvinning och förbättra stabiliteten i dessa proteiner ständigt utvecklas 1-5. Dessa tekniska genombrott har varit avgörande för att utlösa explosionen av atomnivå strukturell information om membranproteiner som i sin tur förbättrade vår förståelse av de strukturella grunderna för deras funktion. Däremot att vår förmåga sondera de funktionella egenskaperna hos de renade proteinerna ökade inte i samma takt, så att i vissa fall hög upplösning strukturell information åtföljs av kvalitativa funktionella data, vilket begränsar vår förmåga att kvantitativt testa strukturbaserade förutsägelser. Således, den development av kvantitativa och generaliserbara funktionella analyser är ett viktigt steg mot att klarlägga de mekanistiska grunderna för membranproteinfunktion.
Här beskriver vi en utflödesanalys som kan användas för att kvantitativt bestämma viktiga funktionella egenskaper hos renade och rekonstituerade Cl – kanaler och transportörer. De principer som ligger till grund för analysen kan generaliseras till en mängd olika transportsystem, liksom till icke jon-transporterande proteiner. Liposomer rekonstitueras med renade CL – kanal / transportörer i närvaro av ett stort Cl – lutning (figur 1A, B). Cl – utflöde initieras genom tillsats av en jonofor att möjliggöra kontra jonflöde, i vårt fall K + jonoforen valinomycin som shunt spänningen fastställts av Cl – lutning och ställa den inledande membranpotentialen till jämviktspotential K + 6,7. Utan tHan jonofor ingen betydande netto Cl – utflöde sker, eftersom det förhindras genom generering av en transpotential. Uppgifterna kvantitativt beskrivs av två mätbara parametrar (Figur 1C): τ, tidskonstant Cl – utflöde, och f 0, den del av liposomer som inte innehåller ett aktivt protein. Från τ och f 0 den enhetliga Cl – transporthastighet, kan den del av aktiva proteiner och molekyl massan av den aktiva komplexet härledas 8. Tekniken illustreras här med proteoliposomer ombildade med CLC-EC1, en väl karakteriserad CLC-typ H + / Cl – växlare av känd struktur och funktion. Denna analys är lätt generaliseras till kanaler eller transportörer med olika joniska selektivitet eller vars verksamhet är beroende av förekomsten av spänning och / eller ligander. Dessutom kan denna analys användas för att bestämma huruvida små molekyler som direkt påverkar den rekonstituerade proteinet,för att kvantifiera effekterna av dessa föreningar och hur membrankomposition eller lipid-modifierande reagens påverkar funktionen av de rekonstituerade kanaler och transportörer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har beskrivit ett detaljerat protokoll för att mäta Cl – transport förmedlad av renade anjon-selektiva kanaler eller transportörer ombildade i liposomer. Exemplet som användes var den prokaryota H + / Cl – växla CLC-EC1. Emellertid kan metoden enkelt anpassas för att studera kanaler gated av ligander 12,13,15, spännings 11,12, eller idrottsliga olika anjoniska selektivitet 15,16 genom att ersätta Ag: AgCl-elektrod med en lämplig för jonen un…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grant GM085232 and an Irma T. Hirschl/ Monique Weill-Caulier Scholar Award (to A.A.).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | 610200 | |
| IEC Centra CL2 Benchtop | Thermo Scientific | ||
| Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter | These can be found on Ebay. | ||
| Non-functional pH probe | Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned. | ||
| DI-710 Data Logger | DATAQ instruments | ||
| WinDAQ acquisition software | DATAQ instruments | ||
| Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml | Pierce (Thermo Scientific) | 29922 | |
| KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass | Kimble Chase | 73500-13100 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids Inc. | 610000 | |
| Computer |
References
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14, 673-681 (2006).
- Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nat Protocols. 3, 784-798 (2008).
- Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20, 1293-1299 (2012).
- Almo, S. C., Love, J. D. Better and faster: improvements and optimization for mammalian recombinant protein production. Curr Opin Struct Biol. 26, 39-43 (2014).
- Xiao, S., Shiloach, J., Betenbaugh, M. J. Engineering cells to improve protein expression. Curr Opin Struct Biol. 26, 32-38 (2014).
- Accardi, A., Miller, C. Secondary active transport mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels. Nature. 427, 803-807 (2004).
- Nguitragool, W., Miller, C. Uncoupling of a CLC Cl-/H+ exchange transporter by polyatomic anions. J. Mol. Biol. 362, 682-690 (2006).
- Walden, M., et al. Uncoupling and turnover in a Cl-/H+ exchange transporter. J. Gen. Physiol. 129, 317-329 (2007).
- Accardi, A., Kolmakova-Partensky, L., Williams, C., Miller, C. Ionic currents mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels. J. Gen. Physiol. 123, 109-119 (2004).
- Basilio, D., Noack, K., Picollo, A., Accardi, A. Conformational changes required for H(+)/Cl(-) exchange mediated by a CLC transporter. Nat Struct Mol Biol. 21, 456-463 (2014).
- Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. Journal of Molecular Biology. 387, 1055-1060 (2009).
- Terashima, H., Picollo, A., Accardi, A. Purified TMEM16A is sufficient to form Ca2+ activated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 19354-19359 (2013).
- Malvezzi, M., et al. Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel. Nature Communications. 4, 2367 (2013).
- Picollo, A., Malvezzi, M., Houtman, J. C., Accardi, A. Basis of substrate binding and conservation of selectivity in the CLC family of channels and transporters. Nat Struct Mol Biol. 16, 1294-1301 (2009).
- Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287, 36639-36649 (2012).
- Stockbridge, R. B., et al. Fluoride resistance and transport by riboswitch-controlled CLC antiporters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15289-15294 (2012).
- Menon, I., et al. Opsin is a phospholipid flippase. Curr Biol. 21, 149-153 (2011).
- Nimigean, C. M., Miller, C. Na+ block and permeation in a K+ channel of known structure. J Gen Physiol. 120, 323-335 (2002).
- Picollo, A., Xu, Y., Johner, N., Bernèche, S., Accardi, A. Synergistic substrate binding determines the stoichiometry of transport of a prokaryotic H(+)/Cl(-) exchanger. Nat Struct Mol Biol. 19, 525-531 (2012).
- Tsai, M. F., Fang, Y., Miller, C. Sided functions of an arginine-agmatine antiporter oriented in liposomes. Biochemistry. 51, 1577-1585 (2012).
- Heginbotham, L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. Functional reconstitution of a prokaryotic K+ channel. J Gen Physiol. 111, 741-749 (1998).
- Lundbaek, J. A., Collingwood, S. A., Ingólfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S. Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes. J R Soc Interface. 7, 373-395 (2010).
- Lim, H. H., Stockbridge, R. B., Miller, C. Fluoride-dependent interruption of the transport cycle of a CLC Cl(-)/H(+) antiporter. Nat Chem Biol. 9, 712-715 (2013).
- Stockbridge, R. B., Robertson, J. L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. A family of fluoride-specific ion channels with dual-topology architecture. Elife. 2, e01084 (2013).
- Nimigean, C., Shane, T., Miller, C. A cyclic nucleotide modulated prokaryotic K+ channel. J Gen Physiol. 124, 7 (2004).
- Brohawn, S. G., del Mármol, ., J, R., MacKinnon, Crystal Structure of the Human K2P TRAAK, a Lipid- and Mechano-Sensitive K+ Ion Channel. Science. 335, 436-441 (2012).
- Jayaram, H., Robertson, J. L., Wu, F., Williams, C., Miller, C. Structure of a slow CLC Cl-/H+ antiporter from a cyanobacterium. Biochemistry. 50, 788-794 (2011).
